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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师( 或指导小组) 的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名单位为河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应的法律责任。研究生签名玮栅导师签名：睁该学院领导签名：伽一年f 月二7 日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导
2、教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。基研究生张吲丝烧翩虢采牦仞传年f 月 7 日目录中文摘要1英文摘要4研究论文T G F 6 1 对滋养细胞H T R 8 S V n e 0 细胞系增殖侵袭的影响及机制研究前言7日U 吾7材料与方法9结果1 4附图1 5附表1 8讨 仑2 2结j 念2 5参考文献2 6综述T G F 一 3 1 s m a d 通路对滋养细胞增殖和浸润的影响的相关研究3l致谢3 8个人简历3 9中文摘要T G F p 1 对滋养细胞H T R - 8 S V n e o 细胞系增殖侵袭的影响 及机制研究摘要目的：滋养细胞是人体极为奇特的细胞，来源于胚胎的胚外
3、层细胞，具有侵蚀性，在胚胎植入过程中，滋养层细胞发挥着类似肿瘤的特性而侵入子宫基质，相应的子宫反应内膜蜕膜化，包括细胞分化及细胞外基质重建，并创造了一个环境，在最初阶段允许滋养层细胞的侵入，继而又控制其过度侵入以形成胎盘。这一侵蚀过程，在时间及空间上受到母体及自身的多种旁分泌和自分泌因子的严格网络级联调控，其中任一环节发生异常，都有可能会导致自然流产、先兆子痫、妊高症、绒毛膜癌等妊娠相关疾病。转化生长因子一p ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r p ，T G F p ) 超家族是有许多细胞因子所组成的大家族，其信号沿T G F p 族
4、配体一受体一S M A D蛋白一转录因子一D N A 表达等步骤来控制调节细胞的增殖、分化、移行和凋亡。T G F B l 是最早证实参与滋养细胞侵入调节的细胞因子。研究发现，受孕子宫内膜表面上皮细胞、基质细胞、蜕膜细胞中T G F - p 1 及T p R较未孕时显著增加；胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及绒毛的间质滋养细胞均有T G F 1 3 1 的表达，T G F p l 调节滋养层的分化，即有助于滋养层的黏附，又避免滋养细胞过度增殖、浸润，但具体机制尚未阐明。本实验以滋养细胞H T R - 8 S V n e o 细胞为模型，采用不同剂量外源性T G F B1 作用于H T
5、R - 8 S V n e o 细胞系，观察H T R - 8 S V n e o 细胞的增殖、侵袭改变，T G F 3 1 S m a d s 信号传导通路中关键组分S m a d 3 、S m a d 7m R N A的表达情况，进一步揭示该信号通路在滋养细胞调控机制中的作用，从而为滋养细胞疾病的治疗提供新的思路。方法：l 本文的研究对象为永生化的滋养细胞H T R - 8 S V n e o 细胞系。2 取指数生长期的H T R - g S V n e o 细胞按初始浓度为3 x1 0 4 m L 接种于9 6 孔板，3 7 、5 C 0 2 培养箱中培养，融合度达到6 0 后换成无血清
6、培养基，使其继续饥饿同步化2 4 h ；然后分别给予2 5 r , g L ，5 O r t g 几，1 0 O p g L ，1 2 5 p g ，L ，1 5 l a g L , 2 5 0 g L ，5 0 0 肛e g L ，1 0 0 0 p g L ，2 0 0 O I J t g m中文摘要的T G F B l 对H T R 8 S V n e o 细胞进行外源性干预，分别于2 4 h 、4 8 h 、 7 2 h 终止培养并收获细胞；同时设立零对照组及空白对照组，每组设6 个平行孔，采用M T T 比色法检测各组细胞的增殖活力；3以3 1 0 4 m L 细胞浓度将H T R
7、- 8 S V n e o 细胞接种到6 孔板，融合度达到6 0 后换成无血清培养基，使其继续饥饿同步化2 4 h ，加入不同浓度的人重组T G F p 1 ，即终浓度分别为0 “g L ( 对照组) ，1 0 肛g L ，1 0 0 昝g L ，1 0 0 g L ，共温育4 8 h 后终止培养，采用逆转录聚合酶链反应( R e v e r s eT r a n s c r i p t i o nP o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o n ，R T P C R )检测各组S m a d 3 、S m a d 7m R N A 表达情况；4以1 1
8、0 5 m L 的细胞浓度将H T R - 8 S V n e o 细胞接种于T r a n s w e l l 小室，分别加入o l u P d L ( 对照组) ，1 0 g L ，1 0 0 “g L ，1 0 0 0 班T G F 一1 3 1共培养4 8 小时，采用T r a n s w e l l 侵袭法检测H T R - 8 S V n e o 细胞的侵袭力。结果：l以不同剂量T G F p 1 分别作用于H T R 8 S V n e o 细胞2 4 、4 8 、7 2 h 后，在T G F p l 浓度相对较低时( 0 1 5 0 p g L ) ，H T R - 8 S V
9、 n e o 细胞随着T G F B 1 浓度的增加细胞增殖情况逐渐明显，但是当T G F 一1 3 1 浓度相对较大时( 15 0 2 0 0 O p g L ) ，细胞的增殖情况又逐渐减弱，总体呈抛物线性变化，与0 p g L 对照组比较，T G F p 1 浓度为1 0 0 1 5 0 p g L显著增高( 尸 0 0 5 ) 。3与对照组比较，T G F B 1 各浓度处理组H T R - 8 S V n e o 细胞穿膜数量明显增加，侵袭力增强( P 0 0 5 ) 。( 见F i g 2 、3 ，T a b 7 ) 3 不同浓度外源性T G F 一1 31 对滋养细胞H T R 8
10、 S V n e o 侵袭能力的影响体外侵袭实验表明，T G F 1 31 作用滋养细胞H T R - 8 S v n e 0 4 8 h 后，随T G F 1 31 浓度增高，各实验组细胞的穿膜细胞数逐渐增加，与对照组比较，差异具有统计学意义( 尸 O 0 5 ，k P O 0 5研究论文T ab l e8T h et r a n s m i g r a t e dc e l l sn u m b e ro f t h eH T R - 8 S V n e oc e l ll i n et r e a t e db yd i f f e r e n tc o n c e n t r a t
11、i o n so fT G F p 1x ：k s ，n = 5 )F = 5 1 4 8 5 ，P O 0 5 ；V SO l a g Lg r o u p ：A P O 0 5 ；V Sl p g Lg r o u p ：P 0 0 5 ；V S10 t g Lg r o u p ：P O 0 5 ：V Sl0 0 I - t g Lg r o u p ：g P O 0 52 1研究论文讨论人类胚胎的成功着床、胎盘的形成、胚胎的生长发育与滋养细胞的增殖和侵袭能力密切相关。增殖和侵袭能力的紊乱将导致一系列的疾病。如侵袭力不足时会导致自然流产、宫内发育迟缓、先兆子痫、妊高征等，而过度的侵入又会
12、导致葡萄胎、侵袭性葡萄胎、绒癌及罕见的胎盘部位滋养细胞肿瘤等【3 1 。所以，滋养细胞增殖与侵袭力的研究对相关疾病的了解具有重要的意义。体外滋养细胞模型的建立是滋养细胞增殖和侵袭能力相关实验的基础。高纯度的原代滋养细胞不容易获得，并且受到传代和数量的限制。目前，对于大多数滋养细胞体外研究，常常用一些永生化的滋养细胞系来替代原代滋养细胞。H T R - 8 S V n e o 细胞系就是G r a h a m 教授在建立原代滋养细胞株H T R - 8 的基础上，近一步导入了含有S V 4 0 区上游基因和新霉素磷酸转移酶基因的p S 3 n e o 质粒，建立的永生化滋养细胞系【2 J 。永生
13、化细胞系保持了原代细胞生物学的特性，能给实验研究带来许多方便。但是永生化的细胞除了和肿瘤细胞一样在体外培养都具有无限增殖能力，可表现为无限传代而不凋亡，同时研究也发现在体外一些诱发因素的作用下，原代细胞可向永生化细胞转化，永生化细胞也可向癌细胞转化【4 1 。不同于肿瘤细胞，滋养细胞的增殖和侵袭过程是受大量复杂彼此联系事件的严格时空调控的。转化生长因子p ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rT G F p ) 就是调控滋养细胞增殖和侵袭的一个重要细胞因子1 5 1 。T G F p 是一种具有重要功能的活性多肽，可以调节细胞生长、分化等
14、，具有广泛的生物学活性，参与早期胚胎发育、软骨和骨的形成、胞外基质的合成、炎症、间质纤维化、免疫和内分泌功能的调节、肿瘤的形成和发展等 6 - 8 1 。研究显示在多种肿瘤中T G F B 1 呈现高表达。如在对乳腺癌的研究中发现T G F B l 表达升高，并且可以促进癌细胞的转移p m j ，在肝癌组织中T G F 一0 1 呈现过表达，并且T G F 岱l 的高表达可以促进肝癌的进程【1 1 1 。研究发现妊娠滋养细胞疾病患者血清中T G F D 1 的水平明显增高l l 引。T G F 一1 3 1 亦能促进绒毛膜癌细胞的增殖和侵袭【1 弘H J 。但是另一方面，T G F 6 1 可
15、以抑制多种类型上皮细胞的增殖，在癌症的早期又相当于一研究论文个肿瘤抑制因子【1 孓1 6 】。对人正常早孕滋养细胞T G F 一1 3 1 有抑制作用，可以抑制滋养细胞的过度增殖和侵袭【l 3 。1 9 1 。由此可见T G F p 1 是滋养细胞增殖和侵袭调节中重要的细胞因子。本实验以9 0 代后H T R - 8 S V n e o 细胞株为研究对象，外源性T G F B 1为干预因子，采用M T T 比色法和T r a n s w e l l 侵袭实验，分别研究不同浓度和不同时间作用下细胞的增殖和侵袭能力的变化。重复多次的M T T实验结果显示在外源性T G F 一6 1 干预的作用下，H T R - g S V n
