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1、学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌态堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名( 手驰槲签字日期乃萨乡月z日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入
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3、 1 1 7 籼4 lY 2 4 2 7 1背景：肺动脉高压( P A H ) 发生的具体机制尚不明朗，已有一系列研究证明，肺血管重构是肺动脉高压的重要病理生理，此过程中一个重要的特征是平滑肌细胞的过度增殖和凋亡抵抗。W n t 3 a f 1 c a t e n i n s u r v i v i n 信号通路已被证明参与多种肿瘤细胞凋亡抵抗过度增殖的调控，但是否与肺动脉高压的发生发展有关尚无研一究证明。本研究旨在通过构建S D 大鼠的肺动脉高压模型，初步探讨W n t 3 “D c a t e n i n s u r v i v i n 信号通路是否参与了P A H 的发生发展，为肺动脉高
4、压的防治提供新的治疗靶点和思路。目的：建立野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压模型，初步研究W n t 3 a 1 3 c a t e n i n s u r v i v i n 信号通路在肺动脉高压发生发展中的作用。方法：将4 8 只S D 大鼠随机分组：( 1 ) P A H 组( 2 4 只) ：一次性皮下注射配好的野百合碱溶剂( M C T ) 5 0 m g K g ，( 2 ) N S 组( 2 4 只) ：一次性给予与P A H 组相同剂量的生理盐水皮下注射。隔日给大鼠行心脏B 超检查，观察各组大鼠右心系统动态变化，分别于第7 天、第1 0 天、第2 1 天( 记为P A H 7 N S
5、 7 、P A H l 0 N S l 0 、P A H 2 1 N S 2 1 ) 行右心导管法测得各组平均肺动脉压( m P A P ) ，随后取出心脏，天平称重测得右心指数( R V L V + S ) ，计算方法为右心室游离壁与左心室+ 室间隔的重量之比，取出肺组织通过H E 染色，利用I P P 6 0 软件测得各组肺小动脉管壁面积占血管总面积的百分比( W A ) 及肺小动脉管壁厚度占血管外径的百分比( W T ) ，以上述结果作为判断模型是否建立成功的指标。实验数据以均数+标准差表示，用S P S S l 4 0 统计学软件对实验结果进行多组间单因素方差分析或t 检验，P 0 0
6、 5 ) 。P A I - 1 2 1 与N S 2 1 两组间肺动脉平均压力、右心指数均出现了统计学差异( n _ 8 ，P O 0 5 ) 。3 2 肺组织的病理学检查l i E 染色根据肺动脉平均压力和右心指数结果，认为N S 组是正常对照组，而P A H 2 11 l第3 章结果组为成功建立的肺动脉高压模型组，由下图可见，P A H 组血管腔与N S 组比较出现明显狭窄，厚度明显增加( 图1 h ) 。因P A H l 0 组与N S 组的肺动脉压力已有统计学差异，所以我们认为第1 0 天是野百合碱造成的大鼠肺动脉高压发生的一个关键时刻，故现对N S 组、P A H 2 1 组、P A
7、 H l 0 组的大鼠肺组织行H E 染色在光镜下利用I P P 6 0 彩图分析软件对选取的肺小动脉( 直径为5 0 - 2 0 0um ) 的管壁面积占血管总面积百分比( w A ) 、肺小动脉管壁厚度占血管外径百分比( W T ) 进行测定。在每组中随机选取切片5 张，再于每张切片中随机选取5 只肺小动脉的结果进行统计学分析，结果显示P A H 21 组与N S 组比较W A 、W T 均有统计学差异( P 0 0 5 ) 。N SP A H l 0P A H 2 l I 、1 1 1 t t一_ l - I l f t - c ：I I c l I I m I 人- ”I lNA 图1
8、 4l4 012 0l0 008 006 004 002 0O 0 0Iaw n t 3 aP A H l 0P A H 2图5 各组大鼠肺组织蛋白的10 009 008 007 006 005 004 003 002 00 1 00 0 0I B - c a t e n i n木IP A H 7P A H l 0P A H 2 1b B 图04 003 50 3 002 502 00 1 50 1 00 0 50 0 0S U r V I V l n木IP A H 7P A H l 0P A H 2 1Cw e S t e mb 1 0 t 分析，图A 为条带，图B 的a 、b 、C 分别为
9、w n t 3 a 、1 3 - c a t e n i n 、s u r v i v i n 的各组肺组织蛋白表达 幸P O 0 5 ) ，但通过w e s t e r nb l o t 测得大鼠肺组织s u r v i v i n 的表达量较正常对照组已有增加。而在第1 0 天，B 超才开始发现部分大鼠出现了三尖瓣返流，此时s u r v i v i n 蛋白的表达较第7 天明显增加，达到增长高峰，右心导管测得的肺动脉平均压较正常对照组已有增加，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ，但此时两组的右心指数尚无统计学差异，且此时H E 染色测得的W A 、W T 较正常组已有增加( P O
10、 0 5 ) 。在整个过程中，s u r v i v i n 蛋白的表达量变化趋势与血流动力学所测肺动脉平均压力变化趋势相吻合，均随着野百合碱的注射时间延长，而呈增加趋势。根据上述结果，我们认为肺血管重构是肺动脉高压发生的一个重要原因之，而非仅仅是高压后的结果，在s u r v i v i n 的介导作用下引起肺组织细胞的凋亡抵抗过度增殖，引起了肺细小血管的重构、闭塞方才造成了肺动脉压力的增加。当然我们相信，肺动脉的压力增加与肺血管重构的发生是恶性循环，肺动脉高压后，肺血管重塑在高剪切力的环境下会进一步恶化。4 3s u r v i v i n 与肺血管重构早在2 0 0 4 年P i e t
11、 r a 等人提出，肺动脉平滑肌细胞( p u l m o n a r ya r t e r i a ls m o o t hm u s c l ec e l l ，P A S M C ) 的凋亡抵抗及增殖凋亡比例失衡是肺小动脉重构并发生P A H 的重要病理学基础【2 。近几年，很多学者认为特发性肺动脉高压与恶性肿瘤的特质类似，即肺血管发生了因细胞凋亡抵抗恶性增殖而造成的不可逆的血管重构。很多学者认为，其预后比恶性肿瘤还差。大量研究证实，s u r v i v i n 在许多恶性增殖的肿瘤细胞中受致癌基因的调控而过度表达眨扣。此次研究中，为探讨s u r v i v i n 对肺动脉重构的作
12、用，在野百合碱造成的S D 大鼠肺动脉高压模型中，结合B 超动态监测，我们在肺动脉高压发展的各个阶段，通过w e s t e mb l o t 检测肺组织s u r v i v i n 蛋白的表达量及免疫组化检测s u r v i v i n 蛋的表达部位。结果显示，在正常对照组中，s u r v i v i n 几乎无表达，在P A H 组中s u r v i v i n 的表达量与细胞的增殖凋亡能力有关，即可认为高表达量的s u r v i v i n 明显促进了细胞的增殖，抑制了细胞的凋亡。而在P A H 组中，第7 天处死的大鼠肺组织s u r v i v i n 的表达量较N S 组
13、第7 天的大鼠肺组织s u r v i v i n 表达量己出现统计学差异( P 0 0 5 ) ，而此时所测的肺动脉平均压力较N S 组并未发生明显变化，所以我们推测s u r v i v i n可能是肺动脉高压的始动因子之一。根据免疫组化结果，各组s u r v i v i n 的表达结第4 章讨论果与w e S t e mb l o t 结果基本相符，且在P A H 组第1 0 天与第2 1 天增加的s u r v i v i n表达均在肺细小血管上。因此，我们认为，野百合碱造成的肺动脉模型大鼠中，s u r v i v i n 是P A H 发生的一个重要的始动因子，它造成了肺血管细胞
14、的凋亡抵抗和过度增殖，从而发生了肺血管床不可逆的恶性重构、闭塞等一系列变化，从肺小血管开始一系列的细胞增殖，血管扭曲狭窄等，最终造成了肺血管压力的增加，可能贯穿了整个肺动脉高压的发生及恶化过程。当然，也并不排除可能是受肺血管压力升高的影响，s u r v i v i n 蛋白进一步增加，血管床再进一步重构因而压力继续较前增加。国外亦有研究证实，通过免疫荧光技术，在特发性肺动脉高压患者的肺平滑肌细胞上可见s u r v i v i n 蛋白表达，而正常人的肺动脉平滑肌、先心分流性的肺动脉高压患者的肺动脉平滑肌细胞上均无s u r v i v i n 表达。因此，我们推断在人的特发性肺动脉高压中，
15、s u r v i v i n 蛋白亦是一个重要的启动因子，这需要进一步的研究证实。近期大量研究指出血小板源性生长因子( P D G F ) 在肺血管恶性重构中发挥重要作用。而国外的进一步基础研究证实，暴露在血浆P D G F 的平滑肌细胞s u r v i v n 有表达，且表达量与血浆生长因子的浓度正相关2 ”，P D G F 的m R N A 、蛋白表达增加与本研究中所示s u r v i v i n 在各个时间段增加趋势相似眩钔，所以不排除s u r v i v i n 与P D G F 协同作用或者通过其他作用方式，造成了肺血管的不可逆重塑，这有待进一步的研究证实。本次的研究中，我们
16、通过在P A H 发生的不同阶段对s u r v i v i n 蛋白表达量和表达部位的检测，进一步证实了s u r v i v i n 在大鼠肺动脉高压中的重要作用，且认为s u r v i v i n 是肺动脉高压发生的一个始动因素。至于s u r v i v i n 与肺血管重构发生的具体机制需要下一步细胞实验的深入探索。4 4W n t l B c a t e n i n s u r v i v i n 信号传导通路2 0 0 7 年H l u b e k 等人研究发现W 州p c a t e n i n 传导通路可上调肿瘤组织s u r v i v i n 的表达，证实了W 州p c a t e n i n s u r v i v i n 信号传导通路的存在，并提示可能参与肿瘤的发生发展过程比引。近几年，W n t B c a t e n i n s
