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1、 第 1卷 第 1期1997年 12 月生命科学研究 Life Science ResearchVol. 1, No. 1 Dec. 1997我国淡水养殖鱼类育种的实践和思考刘 筠a( 湖南师范大学生物学系, 中国长沙, 410081)摘 要 用于鱼类育种的传统方法, 如引种驯化、 选种和杂交, 虽然有其自身的 局限性, 但都是行之有效的. 自本世纪 70年代以来兴起的生物工程技术, 已应用于鱼类育种, 如细胞工程中的雌核发育、 多倍体形成和性别控制等方面都取得了较好的成效. 80 年代以来, 基因工程技术也已用之于鱼类育种的研究中, 并取得了一些成效. 实践证明, 基因工程育种离生产尚有一定
2、距离. 根据当前的实际, 鱼类育种仍然离不开传统方法, 应该是细胞工程和传统方法相结合, 或是细胞工程和基因工程相结合,或是传统方法、 细胞工程和基因工程相结合的综合技术育种.关键词 鱼类育种, 细胞工程技术, 基因工程技术分类号 S961The Practice and Idea of Hereditary Breeding of Chinese Freshwater Aquatic FishesLiu Yun (Department of Biology,Hunan Normal University,Changsha, 410081,PRC)Abstract Although the t
3、raditional methods of fish breeding, such as docility of induced vari- eties, selective breeding and cross breeding, have their limitation, they are effective. Since70s, the biological engineering technique have be used in fish breeding. The cell engineeringtechnique, such as genogenesis, polyploid
4、formation and the control of sex, has produced agood result. Since 80s, the gene engineering technilque is involved in the fish breeding, and it makes some progress. However, the practice proves that there is a distance for the applicationof the gene engineering technique to the production. Accordin
5、g to the present situation, thefish breeding can not abandon the tradition methods. We should combine the cell engineeringtechnique with the traditional methods or combine the cell engineering technique with the gene engineering technique, or combine traditional methods with the cell engineering tec
6、h-nique and the gene engineering technique.Key words fish breeding,cell engineering technique,gene engineering techniquea收稿日期: 1997- 10- 15 作者: 刘筠, 男, 67 岁, 教授, 中国工程院院士1 问题的提出自本世纪 70 年代以来, 在分子生物学形成和发展的基础上, 又产生了一门新兴科学称之为生物技术( Biotechnology) 或生物工程( Bioengineering) . 与鱼类育种相关的生物技术, 包括细胞工程和基因工程. 无疑这两方面的技
7、术将对推进鱼类遗传育种起着非常重要的作用. 然而, 我们在期望于生物工程育种将会出现令人乐观前景的同时, 怎样看待传统育种技术的地位和作用, 必须有清醒的认识。 我曾经撰文讲过: “ 应当肯定, 传统的引种驯化、 有性杂交和选育技 术, 在鱼类育种中仍然是有效的. 如果有了生物工程技术的诞生, 而否定传统技术的存在和它的价值, 那就不是实事求是的态度. 反之, 如果只停留在传统技术的水平上而不加以改进和接受新技术的注入, 也不能适应社会和经济发展的需求” 1. 我们既要看到传统技术在鱼类育种中是行之有效的, 但也要懂得传统技术的局限性, 有必要实事求是地给予评价. 现就我们近年来的实验研究结果
8、 29并参考国内与之相关的工作 1017进行讨论.2 雌核发育2. 1 雌核发育的概念和原理在自然界, 动物的生殖方式有单性生殖和两性生殖之分. 脊椎动物大多行两性生殖, 但在鱼类也有少数种类是行雌核发育( gynogenesis) 的, 例如美洲鱼 将( Oryzias latipes) 和银鲫( Carassius auratus gibeli) 是已经确认为雌核发育的鱼类. 单性生殖与雌核发育不能混为一谈,前者是无需精子的存在可以产生后代, 而雌核发育必须有本种精子或异源精子激发卵子发育,打开个体发育的大门 1.2. 1. 1 鱼类天然雌核发育的生物学原理 鱼类雌核发育可分为天然雌核发育
9、和人工雌核发育. 对鱼类天然雌核发育研究得比较清楚的是我国黑龙江水系的银鲫. 鱼类天然雌核发育的生物学原理主要是: 1) 卵子成熟分裂的特殊方式, 其卵细胞在 DNA 复制后只行一次成熟分裂, 只排出第一极体, 所以卵子的染色体不减少, 仍保持与细胞相同的染色体数( 3N= 150) ; 2) 卵子受精后的非两性融合, 在受精过程中,无论是同种精子或是异源精子, 入卵后都呈凝质的固缩状态, 不能核化成雄性原核( malepronudeus) , 也不能与雌性原核融合. 由于精子不能与卵核融合, 因此由三倍体银鲫卵子经精 子激发发育而成的胚胎仍然保持原来三倍体的结构. 这种经精子( 同种或异种)
10、 激发的银鲫卵子进行雌核发育的现象就叫做天然雌核发育.2. 1. 2 鱼类人工雌核发育的原理和技术人工雌核发育是模拟天然雌核发育的原理进行的. 根据发育生物学的理论基础, 已经达到生理成熟的卵子是具有全部发育潜能的, 当精子( 物理或化学因子) 与之接触, 就可激活卵子进 行胚胎发育. 鉴于天然雌核发育精子入卵后不能在卵质中自然核化这一特点, 人工雌核发育则必须在精子入卵之前人为地进行遗传物质的失活处理. 天然雌核发育的卵子其自身具有不进行第二次成熟分裂, 不排出第二极体的特性, 人工雌核发育则必须作阻止第二次成熟分裂和排出第二极体的处理.根据天然雌核发育的生物学原理, 人工雌核发育必须作两个
11、方面的技术处理: 一是使精子2 生 命 科 学 研 究 1997 年遗传物质失活; 二是人工诱导二倍体的形成. 使精子遗传物质失活的关键技术, 一般是采用CoC射线或紫外线照射. 根据我们在实践中比较上述两种方法, C射线具有较大的穿透力, 便 于大量精子的处理, 其作用是导致染色体断裂, 这种方法受到严格的条件限制, 不便于在农村和没有特殊设备的实验室应用. 紫外线照射法操作简便而且比较安全, 一般实验室和农村有电 源的渔场都可装备应用. 紫外线照射的弱点是穿透力不强, 但可使精液铺薄来弥补. 紫外线的作用是破坏精子头部 DNA 的结构, 但又能保持精子的活动能力, 激活卵子发育. 人工雌核
12、发 育的另一个关键技术是诱导雌核二倍体的形成. 成熟卵子具有全部发育信息的潜能. 与经过照射处理的精子受精, 可以打开发育的大门. 可是单倍体胚胎容易出现单倍体综合症不能成活,必须经过人工诱导二倍体的发生, 胚胎才能正常发育成仔鱼. 当达到生理成熟第 V 时相的鱼类卵子与经过紫外线照射处理遗传物质失活的精子受精后, 诱导二倍体形成的办法, 可在两个 不同发育阶段进行: 一是在受精后不久抑制第二极体外排; 或是抑制第一次卵裂正常进行. 可以通过温度( 冷休克或热休克) 、 静水压和化学( 秋水仙素) 等方法达到抑制的目的. 根据我们的实践, 比较上述 3 种方法, 温度对抑制第二极体外排或是抑制
13、第一次卵裂, 有比静水压和秋水 仙素两种方法操作简便, 效果更为稳定的优点. 附表是我们近年来雌核发育二倍体仔鱼的实验结果 9.附表 几种雌核发育二倍体仔鱼的百分比Table The percentage of diploid fishes of several gynogenetic offsprings亲 本染色体倍化处理parentDoule treatment of chromosome二倍体仔鱼 Diploid gynogenetic offspring /%Famale M ale冷休克 Cold shockV时相卵子来源Sourceofoocyte in phaseVU.V. 处
14、理的精子来源Source of spermtreated by U . V.温度Temperature/时间T ime/min金鱼湘江野鲤23029. 5Gold fishXiangjiang rever carp红鲫湘江野鲤23025. 4Red crucianXiangjiang river carp散鳞镜鲤红鲫23026. 3Mirror carpRed crucian草鱼湘江野鲤53011. 4Grass carpXiangjiang river carp从附表可以看出, 冷休克对鱼类卵子雌核发育二倍化的形成是行之有效的, 只要严格控制了卵子的质量和处理的温度和时间, 二倍化的成功率还
15、可以继续提高. 2. 1. 3 鱼类雌核发育二倍体的识别和性比对雌核发育的鱼必须经过严格的技术鉴定才能认可, 这是因为精子的遗传物质失活和雌3第 1 期 刘 筠: 我国淡水养殖鱼类育种的实践和思考 核的二倍化都并非是百分之百的. 根据我们最近对草鱼人工雌核发育受精细胞学的研究结果表明: 经紫外线( Ultraviolet, UV) 照射的鲤鱼异源精子进入草鱼卵子后有两种情况发生: 一是精核统呈固缩状态, 不能核化发育成雄性原核; 另一是精子头部的遗传物质 DNA 未遭到破坏, 在卵子原核化因素作用下, 形成了雄性原核. 在卵子方面, 虽经冷休克处理, 仍然还是有部 分卵子的第二极体排出, 真正
16、雌核二倍化的也只有 50%( 还可提高) . 故此, 经过人工雌核发育技术处理获得的仔鱼会出现 3 种情况: 1) 精子的遗传物质 DNA 完全被破坏, 不能形成雄性原核, 由二倍化的雌核发育成为真正的雌核发育鱼; 2) DNA 大部分被破坏, 二倍化雌核的染色体会随机整合 DNA 的片段, 在后代中呈现出“ 异精效应” ; 3) DNA 未遭破坏, 合子会发育成杂交 后代, 或由于亲缘关系染色体不相容的干扰, 合子不能发育为仔鱼.根据什么来确定真正是雌核发育鱼?通常遗传标记是可靠的鉴别办法, 附表中列举的几种鱼类, 如金鱼、 红鲫和散鳞镜鲤都有特殊的隐性基因遗传标记. 用湘江野鲤遗传物质失活的精 子( UV 处理) 与金鱼卵子受精, 激活卵子发育, 由于金鱼的双尾性状对湘江野鲤的单尾性状是隐性, 成功的金鱼雌核发育二倍体鱼应完全是双尾, 如果是单尾个体, 可能是杂交后代. 考证是否是真正的雌核发育鱼, 遗传标记固然可作为依据, 但最有说服力的还是染色体数和核型
