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1、 液相色谱仪分离测定奶茶、可乐中咖啡因液相色谱仪分离测定奶茶、可乐中咖啡因 一、一、 实验目的实验目的 （1）了解高效液相色谱仪的结构及基本操作。 （2）了解色谱分离的基本原理，尤其是反相色谱的基本规律。 （3）掌握色谱的基本定性、标准曲线定量方法。 二、实验原理二、实验原理 高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统 和监测系统。本实验当中还配有数据处理装置。 在液相色谱仪中，通过流动相使试样沿色谱柱移动，试样在色谱柱中与固 定相与流动相都发生选择性的相互作用，利用样品的分离系数不同达到分离的 效果。 本实验采用的是液相色谱中的反相分配色谱，反相色谱用的是非极性填料 分
2、析柱（如 ODS-C18），流动相是极性较强溶剂（如甲醇和水），样品根据在 固定相和流动相中的分配系数不同而进行分离。通过标准样品的保留时间进行 定性，以峰面积对浓度绘制的工作曲线定量。通过线性拟合，计算出奶茶和可 乐中咖啡因的浓度。 咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称 1，3，7-三甲基黄嘌呤， 分子式：C8H10N4O2，是由茶叶或咖啡中提取出的一种生物碱，沸点为 178 （升华）熔点 237，溶于乙酸乙酯、氯仿、四氢呋喃等，微溶于水。它能兴 奋大脑皮层，使人精神兴奋。 三、仪器与试剂三、仪器与试剂 1 1. . 仪器仪器 Agilent 1260 型液相色谱仪：真空在线脱气装置；
3、四元梯度泵；多波长检测 器；ODS-C18 柱。 2 2. . 试剂试剂 甲醇（色谱纯）；水（超纯水）；咖啡因标样；奶茶；可乐。 四、实验步骤四、实验步骤 1 1. . 确定实验条件确定实验条件 打开计算机，等计算机启动完毕后，依次打开输液泵、真空在线脱气装置、 柱温箱、检测器的开关。通讯完毕后，设定操作条件。流动相： 甲醇/水 60/40 ；总流速 0.5mL/min 设定在 254nm 波长下进行检测，柱温 30，流动相 的比例可以根据实验内容的需要在控制单元中修改。 2 2. . 样品制备样品制备 将可乐、奶茶倒入烧杯后放在超声波仪中超声脱气，去除奶茶、可乐中溶 解的空气以及大量二氧化碳
4、气体。将脱气后的可乐溶液稀释 5 倍后，通过 0.45m 的滤膜过滤，转移至定量管中备用。将脱气后的奶茶溶液用甲醇稀释 5 倍后、离心，取上层清液通过 0.45m 的滤膜过滤后，转移至定量管中备用。 准确称量 10mg 的咖啡因用甲醇溶解于 10ml 的容量瓶中作为母液，再分别 从母液中移取 0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL 溶液至容量管中，然后分别稀 释至 10mL。 3. 3. 样品测定样品测定 （1）流动相比例设为甲醇/水60/40，依次将咖啡因标准溶液进样 5L （利用六通阀进样器的定量管进行准确定量），以得到咖啡因在此色谱条件下 的保留时间以及各个浓度下咖啡因的峰面积
5、。 （2）将未知浓度可乐、奶茶溶液进样 5L，以获得此溶液中咖啡因的保留 时间及峰面积。 五、数据处理五、数据处理 实验数据记录如下： 编号编号 咖啡因浓度咖啡因浓度 /mg/ml/mg/ml 保留时间保留时间/min/min 峰面积峰面积/ / mAU*smAU*s 1 0.0250.025 7.0217.021 271.12543271.12543 2 0.050.05 7.0377.037 660.54645660.54645 3 0.10.1 7.0517.051 1312.607911312.60791 4 0.20.2 7.0627.062 2594.934332594.93433
6、 5 0.30.3 7.0717.071 3812.948733812.94873 6 奶茶样品奶茶样品 7.0917.091 738.43213738.43213 7 可乐样品可乐样品 7.0997.099 422.83017422.83017 根据以上实验数据可以绘制标准曲线如下图所示： 0.000.050.100.150.200.250.3005001000150020002500300035004000数 据 点拟 合 曲 线峰 面 积咖 啡 因 浓 度/mg/mlLinear Regression for Data1_B: Y = A + B * X Parameter Value
7、Error - A 1.66476 32.60916 B 12805.68749 192.73779 - R SD N P - 0.99966 43.95098 5 0.0001 - 由所得参数可知，直线的线性拟合程度较好，咖啡因浓度与峰面积满足关系 式： Y=12805.68749X+1.66476 X=（Y-1.66476）/12805.68749 奶茶样品所得峰面积为 738.43213，代入上式得到奶茶中咖啡因浓度为 0.0575mg/ml. 可乐样品所得峰面积为 422.83017，代入上式得到可乐中咖啡因浓度为 0.0329mg/ml. 六、结果与讨论六、结果与讨论 本次实验通过高
8、效液相色谱仪的使用，测得了奶茶和可乐样品中咖啡因浓 度分别为 0.0575mg/ml，0.0329mg/ml.与标准值基本相似。由此可见通过液相色 谱法所得的数据基本可信。虽然液相色谱的检测器灵敏度相对于气相色谱检测 器灵敏度要差，但在所得的标准曲线吸光度的线性关系上较为符合，而且对温 度的变化不是特别敏感。分配色谱法主要用于分离相对分子质量小于 3000 的极 性化合物，而咖啡因沸点为 178（升华），不适合气相色谱，适合于液相色 谱。 七、思考题七、思考题 （1）反相分配色谱的分离原理是什么？ 反相分配色谱属于分配色谱的一种，固定相为非极性，流动相为极性。在 混合溶剂中，有机溶剂吸附于填料的烷基配基层的表面，而溶质分子则在流动 性及吸附了有机溶剂分子的烷基配基层中进行分配。在柱中经过多次分配后便 能使具有不同分配系数的混合物得到分离。 （2）液相色谱的优缺点？ 液相色谱的优点：LC 不受试样挥发度和热稳定性的限制，分离效率较高， 选择性较好，操作自动化，应用范围广，流动相种类多，且受温度影响较小。 缺点：没有 GC 灵敏快捷，分析成本较高，维护费用也贵（GC 出现故障时 才需要）。 参考文献参考文献 【1】武汉大学化学系.仪器分析 P385-P404.高等教育出版社，2001
