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1、植物学通报 2005, 22 (3): 284 291Chinese Bulletin of Botany教育部振兴行动计划项目和北京林业大学研究生培养基金项目资助。 通讯作者。Author for correspondence. E- mail: 收稿日期: 2004- 06- 24 接受日期: 2005- 01- 16 责任编辑: 于昕特 邀 综 述反义 RNA 技术在花色育种中的应用白新祥 戴思兰(北京林业大学园林学院 北京 100083)摘 要 反义RNA技术是用反义RNA链去抑制靶基因的活性, 从而达到对目的基因调控的一项分子生物学技术。该项技术应用于观赏植物的花色育种已有16年的
2、历史并且取得了一定的成就。到目前为止, 已经利用该技术对14种花卉花色形成过程中的3大类基因进行了正义和反义导入, 获得了花色改变的转基因植株。本文简要回顾了反义RNA技术的产生与发展, 并在介绍花色形成的分子生物学的基础上, 综述了国际园艺育种中利用反义RNA技术调控花色基因表达的研究进展, 以期为花色改良的分子育种提供参考资料。关键词 花色, 反义RNA, 花色素苷, 观赏植物Application of Antisense RNA Technology in Production of Color- altered FlowersBAI Xin- Xiang DAI Si- Lan(Co
3、llege of Landscape Architeture, Beijing Forestry University, Beijing 100083)Abstract Antisense RNA molecules deactivates target gene by binding to the sense strand. Thisallowed the application to the molecular alteration of flower color. To date, 3 kinds of genes have beentransformed into 14 cultiva
4、rs for this purpose and transgenic plants with color- altered flowers havebeen obtained. This paper briefly reviews the progress of antisense RNA technology and its use inflower color improvement.Key words Flower color, Antisense RNA, Anthocyanin, Ornamental plant近20年来, 随着改革开放的深入和人民生活水平的提高, 我国的花卉业得到
5、了迅速的发展。但是, 目前存在的一个最大的问题就是我们的花卉企业拥有自主知识产权的花卉品种很少, 一些大宗花卉的生产只能靠引进国外品种。这样虽然在短期内有一定的效益, 但却长期受制于人。造成这种被动局面的主要原因之一就是我们的花卉育种工作相对滞后(李惠芬和李倩中, 1999)。基因工程自20世纪80年代诞生以来, 以其育种周期短、效率高、培育植物定向性强和可跨物种进行遗传物质交流等优点成为花卉育种的一种重要手段而得到广泛应用(白新祥和戴思兰, 2004)。 花色是花卉的一个主要的观赏性状, 近年来成为花卉分子育种的一个热点2852005白新祥等: 反义RNA技术在花色育种中的应用(Forkma
6、nn, 1991; 包满珠, 1997)。利用转基因技术进行花色改良屡见成功报道, 尤其是反义RNA技术在花色分子育种上的应用已有十多年历史, 并取得了一定的成功(van der Krol et al.,1988)。 本文对反义RNA技术在观赏植物花色育种上的应用现状进行了综述, 希望能为运用本项技术解决目前花色育种中的难题提供参考。1 反义RNA技术的产生与发展反义RNA(antisense RNA)是指一些与特定RNA(多为mRNA)或DNA互补的小分子量的可扩散DNA转录物, 它们通过特异性的碱基互补方式控制基因的表达和参与基因表达的调控(张惠展, 1990)。 反义RNA最早是Kawa
7、ji等(1979)在研究大肠杆菌(Escherichia coli)外膜蛋白基因表达时发现。 Tomizawa和Itoh(1981)报道了反义RNA在大肠杆菌的Col E1质粒DNA复制中的调节作用。 Simons和 Kleckner(1983)进一步证实反义RNA在大肠杆菌质粒复制中具有识别和调节的功能。由此反义RNA技术研究得到重视。早期的研究多集中于原核生物, 比如在转座子Tn10、- 噬菌体和大肠杆菌基因组均发现有反义RNA存在。 直到Ecker和Davis(1986)发现真核生物中自然存在反义系统以后,其作用机理的研究引起了人们的极大兴趣。一般认为, 反义RNA通过与靶基因进行碱基配
8、对的方式参与有关基因的表达调控(Patzel andSczakiel, 2000)。 主要的作用方式是在DNA的复制、转录和翻译3 个阶段进行调控(石东乔和陈正华, 2001)。特别是自Izant和Weintraub(1984)首次证实人工构建的反义寡核苷酸在真核生物中具有生物学效应以来, 反义技术在真核生物中的研究得到迅速发展(Izant andWeintraub, 1985; Ecker and Davis, 1986)。 随着反义RNA的研究逐步深入形成了反义技术, 这为人为控制基因表达提供了一种更为直接有效的方法(Park et al., 2002; Raponi and Arndt,
9、2002)。目前, 反义RNA技术已成为反义技术中使用的主要方法之一, 渗透到反向遗传学的各个领域, 诸如抗病因子、反向筛选标记基因、农艺品质改良和次生代谢途径的调控等研究。微注射的反义RNA及天然的或构建的反义基因转录物均有可能对目的基因专一性地起抑制作用(宋俊歧等, 1997)。2 花色形成的分子生物学采用反义RNA技术进行花色分子育种的研究, 依赖于对花色形成分子生物学研究的突破性进展。花色形成是指植物营养生长发育停止后, 进入生殖生长阶段, 花器官发育过程中合成一系列的色素化合物而使花朵显现出一定的颜色。花色的分子生物学研究是以黄酮类化合物的生物合成途径的解析为突破口的, 经过多年的研
10、究已取得了丰硕的成果(Harborne, 1994;Bohm, 1998; Wang et al., 2001; Williams andGrayer, 2004)。在过去的50年里, 人们对该类化合物在遗传、生化和分子生物学方面都做了详细的研究, 其合成途径已基本搞清楚(Springob, 2003)。 目前已经了解了花色形成的化学和分子生物学的详细过程, 所以在传统育种工作的基础上, 利用分子生物学的手段进行花色育种是十分必要的(燏徐清和戴思兰, 2004)。2.1 花色色素概况植物的花色主要由黄酮类化合物、类胡萝卜素和生物碱 3 类物质决定(Tanaka et al.,1998; 何小玲
11、和王金发, 1998)。类胡萝卜素存在于质体内, 一般呈现黄色、橙色和红色等。类胡萝卜素的显色和分子中的共轭双键数有密切的关系, 随着共轭双键数的增加其颜色就越偏向红色, 另外至少要有7个共轭双键时才能呈现出黄色。黄酮类化合物存在于液泡内, 根据中间吡喃环氧化程度的不同, 将黄酮类化合物分为12 类, 即查耳酮(chalcone)、橙酮(aurone)、黄酮(flavone)、黄酮醇(flavonol)、黄烷酮(flavanones)、二氢查耳酮(dihydrochalcone)、28622(3)儿茶精类(catechins)、 黄烷- 3- 4- 二醇(flavan- 3-4- dilos)
12、、双黄酮 (biflavonoids)、异黄酮(isoflavonoids)、原花色素(proanthocyanidins)和花色素苷(anthocyanin) (Madhuri and Arhula,1999)。黄酮类化合物中除花色素苷是红色系外, 均属黄色系。查耳酮和橙酮是深黄色, 其他为淡黄色或近于无色。生物碱类色素有小蘖碱、罂粟碱和甜菜碱等。2.2 花色素苷的生物合成对于花色素苷生物合成途径的研究已十分详尽 (Jayaram, 1990; Forkmann, 1991; Springob,2003)。其中 3 种植物在研究合成途径和基因分离中起至关重要的作用, 即玉米(Zea mays
13、)、金鱼草(Antirrhinum majus)和矮牵牛(Petuniahybrida) (Tanaka et al., 1998)。黄酮类化合物由花色素苷和花黄色素组成, 而花黄色素又是花色素苷合成过程中的中间产物。因此, 所谓黄酮类化合物的合成途径其实就是指花色素苷的合成途径(图 1)。从这个图中可以看出控制花色形成的结构基因 CHS、CHI、DFR、F3H 和 F35H 等对花色色素的合成非常重要, 对这些结构基因实施正义或者反义的调控能够对花色进行改良。3 应用反义RNA技术进行花色改良将反义链连接在表达载体上, 用其转化花卉, 通过来抑制黄酮类化合物生物合成过程中的某个基因的活性,
14、从而改变花色合成的产物,进而改变花色。3.1 对CHS基因的调控从图1可知, CHS催化4- 香豆酰CoA与丙二酰 CoA缩合成柚配基查耳酮。CHS基因最初从欧芹(etroslium hortense)中分离到, 它在矮牵牛中由810个成员组成。 植物正常发育过程中只有CHS- A和CHS- J表达, 且这种表达只能在花中。有关研究表明, CHS不仅是植图 1 黄酮类化合物的生物合成途径 CHS. 苯基苯乙烯酮合成酶; CHI. 苯基苯乙烯酮黄烷异构酶; FLS. 黄酮醇合成酶; DFR. 二氢黄酮醇4- 还 原酶; F3H. 黄烷酮 3- 羟化酶; ANS. 花色素合成酶; F35H. 黄烷
15、酮3.5 - 羟化酶; F3H. 黄烷酮3- 羟化酶; UF3GT. UDPG:类黄酮 - 3- O- 葡糖基转移酶 Fig. 1 Biosynthetic pathway of flavonoids CHS. Chalcone synthase; CHI. Chalcone isomerase; FLS. Flavonol synthase; DFR. Dihydroflavonol reductase; F3H. Flavonoid 3- hydroxylase; ANS. Anthocyanidin synthase; F35H. Flavonoid 3, 5- hydroxylase;
16、 F3H. Flavanone 3- hydroxylase; UF3GT. UDP- glucose:flavonoid- 5- O- glucosyltransferase2872005白新祥等: 反义RNA技术在花色育种中的应用物花色形成途径中的关键基因, 而且还与CHI及 DFR 之间存在着相互作用。所以最早进行花色改良的研究者就选择了 CHS 作为调控对象。对 CHS 的反义调控使花色素合成被打断而使花色变淡, 甚至变成白色或者粉色, 所以是淡色花育种的一条途径。 van der Krol等(1988)将CHS的cDNA反向连接于CaMV的35S启动子上, 再连接双元载体Bin19转化矮牵牛, 使花色由紫红色变为粉红色并夹有白色, 有些花朵完全呈白色。 Courthey- Gutterson和Napoli(1994)将菊花(Dendranthema grandi
