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1、浙江大学硕士学位论文银杏萜内酯的体外代谢及其药物相互作用姓名：裘雅渔申请学位级别：硕士专业：药物分析学指导教师：姚彤炜20050401浙江大学硕士学位论文药学院药物分析学专业裘雅渔银杏萜内酯的体外代谢及其药物相互作用浙江大学药学院药物分析学专业2 0 0 1 级硕士研究生导师裘雅渔姚彤炜教授摘要银杏f G i n k g ob 曲o b a ) ，原产于中国，是最古老的中生代裸子植物之一，是珍贵的药用植物。银杏叶提取物( 简称E G b ) 中主要活性成分是银杏黄酮和银杏惦内酯。银杏萜内酯是一组化合物，主要包括银杏内酯和白果内酯。银杏内酯属了二二萜类，主要有银杏内酯A 、B 、C ( 简称G
2、A 、G B 、G C ) ，它们分子中都具有独特C 2 0 “ 笼型”结构，由六个五元环组成；白果内酯属于倍半萜类，由四个五元环组成( 简称B B ) 。银杏萜内酯是银杏中特有的化合物，迄今尚未发现存在于其他任何植物中。银杏萜内酯具有显著药理活性：对肝、胃、肾有保护作用；能抗脂质氧化和清除体内自由基：具有抗病毒消炎、抗癌作用等等。大量实验证明银杏内酯A ，B ，C 是天然P A F 拮抗剂，对中枢神经系统和心血管系统有保护作用，这些药理作用使它成为在临床二治疗和预防心脑血管疾病的首选天然药物。因为银杏萜内酯的特殊的化学结构和分析上的难度，其分子结构中无紫外吸收特征基团，在紫外2 0 0 2
3、2 0 n m 处仅有很微弱的吸收，所以在现有的文献中，相对于银杏黄酮的研究文献，有关银杏萜内酯的研究文献比较少，尤其是关于银杏萜内酯的吸收、分布、代谢和排泄等体内过程的报道更少。为了解银杏萜内酯的体内过程，本文建立了鼠肝微粒体孵育液中银杏萜内酯的含量测定方法，研究了银杏萜内酯在鼠肝微粒体中的体外代谢情况，考察了银杏萜内酯相互之间的代谢影响。1 H P L C - E L S D 法测定鼠肝微粒体中银杏内酯及白果内酯的方法学研究目的：建立微粒体中银杏萜内酯的H P L C - - E L S D 含量测定方法。方法：以浙江大学硕士学位论文药学院药物分析学专业装雅渔D i a m o n s i
4、 l T MO D S 。C 1 8 为色谱柱；甲醇一水( 3 7 ：6 3 ) 为流动相，流速1 0 m L m i n l ；蒸发光散射检测器( E L S D ) 检测：漂移温度6 0 。C ，雾化气压力2 5 b a r ，增益值9 。鼠肝微粒体孵育液中的银杏萜内酯用乙醚提取，空气流下挥于乙醚，残渣用适量流动相溶解，取4 0uL 进样，测定剩余银杏内酯A ，B ，C 和白果内酯的含量。对鼠肝微粒体孵育液中银杏内酯的H P L C - - E L S D 法进行方法学研究，并应用于银杏内酯的体外代谢研究。结果：银杏内酯A 、银杏内酯B 、银杏内酯C 和白果内酯分别在6 8 0 1 3 6
5、 0 1 t g - m L ，5 4 01 0 9 0 9 9 m L - 1 ，3 6 7 2 0 p g l n L _ j 和3 3 0 - -1 3 3 6 0 t g m L 1 浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数Y 分别为O 9 9 3 6 ，0 9 9 6 4 ，0 9 9 5 9 和O 9 9 3 0 ( n = 5 ) 。测得定量限分别为3 3 0 9 9 m L ，6 8 0 I _ t g m L l ，5 4 0g g m L “和3 6 0 肛g m L 。( R S D 9 9 9 9 ，杭州气体厂) 。实验部分一、H P L C E L S D 法测定鼠肝微
6、粒体中银杏内酯及白果内酯的方法学研究1 、实验方法1 I 色谱条件分析柱：D i a m o n s i l T M - O D S ( 4 6 2 5 0 m m ，5 p m ) ：流动相：甲醇一水( 3 7 ：6 3 ，v v ) ，流速l m L m i n ；柱温3 0 。C ；进样量4 0 9 L 。蒸发光散射检测器：漂移管温度6 0 ：高纯氮为载气，压力2 5 b a r 。1 2 对照品储备液的制备分别精密称取对照品白果内酯( B B ) 1 3 4 0 m g 及银杏内酯A 、B 、C ( G A ，G B ，G C ) 各1 3 6 0 m g ，1 0 ，9 0 m g
7、和1 4 4 0 m g ，置1 0 m L 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，使B B 、G A 、G B 和G C 的浓度分别为1 3 4 ，1 3 6 ，1 0 9 ，1 4 4m g m L “( 合4 0 8 ，3 0 9 ，2 5 7 ，3 1 6 r e t o o l L 0 1 ，放置在4 “ C 冰箱中备用。1 3 银杏萜内酯提取物溶液的制各及其含量的测定 2 0 , 2 1 】精密称取银杏叶提取物2 2 7 6 m g ，加水2 0 m L ，水浴加热溶解，然后加几滴2 盐酸，用乙酸乙酯萃取四次( 3 0 ，2 0 ，2 0 ，2 0 m L ) 合并萃取液，回收溶剂至干，
8、残渣以丙酮5 m L 溶解，上至氧化铝小柱( 氧化铝，中性，2 0 0 3 0 0 目) ，用4 0 m L 丙酮洗脱；沈脱液减压回收溶剂，残渣用甲醇溶解并稀释至1 0 0 0 m L 。浙江人学硕士学位论文药学院药物分析学专业装雅渔取4 0 此进样，在上述色谱条件下测定银杏内酯含量。另取上述4 个对照品储备液适量，混合，用甲醇稀释制成高、低浓度两个对照溶液，同法测定，以外标两点法计算供试品溶液中G A 、G B 、G C 和B B 的百分含量，测得银杏提取物溶液中各成分含量如下：G A1 0 6 5 ；G B1 9 0 ：G CO 9 7 ：B B4 5 6 。计算得银杏提取物溶液中银杏内酯
9、A ，B ，C 和白果内酯的浓度分别为2 4 2 ，0 4 3 ，0 2 2 ，1 0 4 m g m L 。( 合5 5 0 ，1 0 1 ，O 4 8 ，3 1 8 m m o l L 1 ) ，并以此溶液作为银杏内酯体外代谢孵育的底物溶液。1 4 动物预处理和鼠肝微粒体的制备取体重1 3 0 1 6 0 9 的艿S p r a q u e D a w l e y 大鼠9 只，由中科院上海动物实验中心提供，按体重均分为4 组：苯巴比妥组( P B ) 、B 一萘黄酮组( B N F ) 、地塞米松组( D e x ) 和对照组。苯巴比妥溶于生理盐水，8 0 m g k g d ，i p ，
10、3 d ：B - 萘黄酮溶于茶油，8 0 m g k g - 1 d ，i p ，3 d ；地塞米松混悬于水10 0 m g - k g - 1 d ，i g ，3 d ；对照组不给任何药物。末次给药后8 小时丌始禁食，将禁食1 6 小时的大鼠断头处死，剖腹，用注射器吸取2 0 m L 经冰浴冷却的生理盐水，经胸动脉或门静脉注入肝脏，灌流除去肝中血液。取出肝脏，按文献法1 2 2 1 ，用钙盐沉淀法制备鼠肝微粒体。以L o w e f f 法【2 3 】测定蛋白质浓度。1 5 鼠肝微粒体中待测样品的处理与测定取失活的鼠肝微粒体适量( 超声处理2 0 m i n ) ，用T r i s H C
11、I ( P H7 4 ，1 M ) 5 0 L ，T f i t o n ( 2 2 5 m g 。m L “) 5 0 p L ，M g C l 2 ( 1 M ) 1 0 肛L ，K H 2 P 0 4 和K 2 H P 0 4( P H7 4 ) 的缓冲液组成的孵育体系稀释成蛋白终浓度为1 0n a g m L 。的混悬液，取此混悬液1 0 m L ，加适量的对照品储备溶液( 混悬液中的有机溶剂浓度不能超过2 ) ，混匀，不经过孵育，加2 m L ，乙醚终止反应，并沉淀蛋白，旋涡提取2 m i n ，3 5 0 0 I p m离心1 0 m i n ，取有机层于空气流F 挥干，加流动相O
12、 1 m L 溶解残渣，取4 0 9 L 进样分析。1 6 方法专属性试验取失活的微粒体溶液加定量银杏萜内酯对照品的甲醇溶液，按“鼠肝微粒体中待测样品的处理与测定”项下的方法处理，作为样品测定液：另取失活的微粒体溶液，同法操作，作为空白对照液。取样品测定液、空白对照液和银杏萜浙江大学硕上学位论文药学院药物分析学专业裘雅渔内酯对照品储备液分别进样测定，记录各色谱图和色谱参数，对所得色谱图进行比较。1 7 标准曲线和检测灵敏度分别吸取B B 、G A 、G B 和G C 标准储备液各适量，加到失活的鼠肝微粒体悬浮液中，使终浓度分别为B B3 3 0 1 3 3 6 0 1 - t g - m L
13、。( 1 0 1 4 0 7 3 m o l L - 1 ) ，G A6 ，8 0 1 3 6 0 Hg m L “( 1 5 5 3 0 9 1 9 m o l L 。) ，G B5 4 0 1 0 9 。0 p g m L 1 ( 1 2 7 2 5 7 1 1 x r n o l L 。1 ) G C3 6 7 2 0 p , g m L 。( 7 9 1 5 7 9 p , m o l L 。1 ) 。按“鼠肝微粒体中待测样品的处理与测定”项下方法操作，测定各成分的色谱峰高，以各内酯浓度的对数值( 1 0 9 C ) 为横坐标，峰高的对数值( 1 0 9 H ) 为纵坐标，计算曲线的回
14、归方程和相关系数。采用逐步稀释法测定鼠肝微粒体中B B 、G A 、G B 和G C 的定量限和检测限。1 8 准确度和精密度试验于失活孵育液中，精密加入高、中、低浓度的银杏内酯对照品溶液适量，使得孵育液中的终浓度，G A 为：6 8 0 、3 4 0 、1 7 0 t x g m L 。( 1 5 4 5 、7 7 2 5 、3 8 6 0 9 m o l L 。) ；G B 为：5 4 0 、2 7 0 、1 3 6 5 9 9 m L 。( 1 2 7 4 、6 3 7 、3 2 2 0 J m a o l L 。) ；G C 为：3 6 0 、1 8 0 、9 0 9 9 m L 1
15、( 7 8 9 、3 9 5 、1 9 7 0 p m o l L “) ；B B 为：3 3 4 、1 6 7 、8 3 0 p , g ，m L J ( 1 0 1 8 、5 0 9 、2 5 3 9 m o l L 。) ；按上述“标准曲线和检测灵敏度”项下方法操作，将测得的峰高值H 一取对数得l o g H * ，代入上述“标准曲线和检测灵敏度”项下得到的回归方程中，求得测定量，然后与加入量进行比较，计算方法回收率，每个浓度至少平行测定5 份，求出精密度；同时另取相同浓度的银， 杏萜内酯的对照品甲醇溶液进样，得银杏萜内酯的峰高H 真，根据下式计算提取回收率：提取回收率( ) = H $ 胛A 1 0 0 。1 9 稳定性考察1 9 1 对照品储备溶液的稳定性将1 2 节卜预先配置好的G A 对照品储备溶液精密吸取2 0 m L ，G B 对照品储备溶液2 0 m L ，G C 对照品储备溶液1 0 m L和B B 对照品储备溶液1 0 m L 加到5 m L 的容量瓶中，用甲醇稀释成终浓度分别为：G A5 4 4 0 9 9 m L 。( 1 2 3 6 4F x m o l L 一1 ) 、G B4 3 6 O U g m L 一1 ( 10 2 8 3 9 m o l L 。1 ) 、G C2 8 8 0 9 9 - m L ( 6 31 6 p x
