细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结

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1、 一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法法实验原理：Cell Counting Kit-8（简称 CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有 WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5- (2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】 ，它在电子载体 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1- Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物 （Formazan dye） 。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成

2、正比。因此可利用这一特性直接 进行细胞增殖和毒性分析。一、用途：一、用途： 药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。二、优点：二、优点： 1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8 法能快速检测； 3.CCK-8 法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8 法的重复性优于 MTT 法，MTT 实验生成的 formazan 不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解； 5.而本方法产生的 formazan 是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步 骤带来的误差； 6.CCK-8 法对细胞毒性小，可以多次测定选

3、取最佳测定时间，与 MTT 方法相比线性范围更 宽，灵敏度更高； 7.CCK-8 细胞活性检测试剂中为 1 瓶溶液，毋需预制，即开即用。三、所需设备及仪器：三、所需设备及仪器： 1. 10ul，100-200ul 及多通道移液器 2. 酶标仪（带有 450nm 滤光片） 3. 96 孔培养板 4. 二氧化碳培养箱一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 四、方法及步骤：四、方法及步骤：实验一：细胞增殖分析实验一：细胞增殖分析 1、制备细胞悬液：细胞计数。 2、接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数（约 1-2104） ，每孔约 100ul 细胞悬液，同 样的样本可做 4-6 个重复。 3、37培

4、养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 4 小时，如果不需要贴壁，这步可以 省去。 4、加入 10ul CCK8：由于每孔加入 CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差， 建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置 含 10%CCK8 的培养基（现用现配） ，以换液的形式加入。 5、培养 0.5-4 小时:细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话， 可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点） 。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6 小时） 。 6、测定 450nm 吸

5、光度：建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490nm，参比波长 600- 650nm。实验二：细胞毒性分析实验二：细胞毒性分析1、制备细胞悬液：细胞计数 2、接种到 96 孔板中：根据合适的铺板细胞数（约5104） ，每孔约 100ul 细胞悬液，同 样的样本可做 4-6 个重复。 3、37培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养 4 小时，如果不需要贴壁，这步可以 省去。 4、加入不同浓度的毒性物质。 5、37培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性， 一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72 小 时） 。 6

6、、加入 10ul CCK8：由于每孔加入 CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差， 建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。 7、培养 0.5-4 小时:细胞种类不同，形成的 Formazan 的量也不一样。如果显色不够的话， 可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的 Formazan 很少，需要较长的显色 时间（5-6 小时） 。 8、测定 450nm 吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490nm，参比波长 600- 650nm。五、实验注意事项：五、实验注意事项： 若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10 L 0.1M

7、 的 HCL 溶液或者 1% w/v SDS 溶液， 并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加 CCK8 之前更换新鲜培养基（除去培养基， 并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基） ，去掉药物影响。当然药物影响比较小的一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 当使用标准 96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为 1,000 个/孔 (100 l 培养基)。 检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于 2,500 个/孔 (100 l 培养基)。

8、酚红和血清对 CCK8 法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消 去。 CCK8 可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要 避免细菌污染，以免影响结果。 CCK-8 在 0-5下能够保存至少 6 个月，在-20下避光可以保存 1 年。 当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误 差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者 PBS，不作为测定孔用。 在培养基中加入 CCK8，培养一定的时间，测定 450 nm 的吸光度即为空白对照。在做加 药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入 CCK8，培养一定

9、的时间， 测定 450 nm 的吸光度作为空白对照。 金属对 CCK-8 显色有影响：当终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100%抑制。 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。 加入 CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 值已变化，建议换用新鲜的 培养基。 用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。六、经验总结及分享：六、经验总结及分享：CCK8 的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里

10、提 供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无 论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。 以下言论全部以细胞毒性试验为前提， 如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就 另当别论了。摸条件包括 1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间； 4、cck8 试剂加入量；5、cck8 试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实 验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和 CCK8。一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记

11、住还要参考 说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全， 一般贴壁生长 24 小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我 拟定考察 4 天的时间，那么在 4 天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设 置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8 试验最佳 OD 值在 1.0 附近，所以这个最大数值最好能控制在 1.0 左右。我的实验经验是不要让细胞 长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一， 其二生长不均匀易导致孔间 OD 值数据偏差大，而且 OD 值也很

12、大。2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长 24h 了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这 样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。3、加药后的孵育时间，我的实验摸了 3 个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性 （RSD） 、OD 值的范围（1.0 左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆 在孔里几天不换液结果可想而知了。4、CCK8 试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的 10%。这里有一个问 题：假设我要孔内是 200 微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200 微升呢，还是细胞悬液 +药液=200 微升，cck8 不

13、算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是 后者。5、cck8 试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD 值就会增大。总之原则就是把 OD 值 控制在 1.0 左右。这里我考察了 0.5h、1.0h、2.0h。再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。 一般每组样品我会设置 6 个复孔，得到的 OD 值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我 用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最 适枪头了。做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多 怎样摸条件，其实就一个原则，把 OD 值控制

14、在 1.0 左右。数据不稳定也只能通过增大样品 数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。补充补充 突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡， 就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得 拿掉啊 Big Smile 补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键： 将 OD 值控制在 1.0 这个说法是否有依据？这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且 作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的 CCK8 试剂盒，说明书的

15、 P7Q23：OD 值在什么范围比较合适？答：一般情况下 OD 值在 0.1-2.0一站式科研技术服务商武汉金开瑞生物 都可以，在 1.0 附近比较好。再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以 UV 上 很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么 要擦拭干净样品板了。再者熟悉 UV 原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围， 超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。 （大家可以把自己的数据统计分析看看 是不是数值控制在 1.0 附近更稳定。 ）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为。 我在摸条件的时候，cck8 加入 2.0h 后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。