质粒构建以及阅读

《质粒构建以及阅读》由会员分享，可在线阅读，更多相关《质粒构建以及阅读（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、如何阅读质粒图谱如何阅读质粒图谱 最近由于实验需要,需要查阅载体图谱,到园子里搜罗一番,发现虽然有人问 载体图谱阅读的问题,也有前辈回答,但都不详细,借自己也在琢磨这个问题的机 会,将我学到的东西整理一下,于大家分享。 载体主要有病毒病毒和非病毒非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因 载体。一个合格质粒的组成要素一个合格质粒的组成要素 #复制起始位点 Oril 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个 复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。 抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如 Amp+l ,Kan+ 多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段 l

2、 P/E 启动子/增强子 l Termsl 终止信号 加 poly（A）信号 l 可以起到稳定 mRNA 作用二、如何阅读质粒图谱二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看首先看 Ori 的位置的位置，了解质粒的类型（原核原核/真核真核/穿梭质粒穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解 内酰胺环内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶使 G418（卡那霉素衍生物）失活

3、（卡那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素潮霉素 失活。 第三步：看多克隆位点（看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基 因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活， 而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源再看外源 DNA 插入片段大小插入片段大小。质粒一般只能容纳小于质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源的外源 DNA 片段片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率 越低。 第五步：是否含有表达系统元件表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转启动子核糖体结合位点克隆位点转

4、录终止信号录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达克隆载体中加入一些与表达 调控有关的元件即成为表达载体。调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号 启动子促进 DNA 转录的 DNA 顺序，这个 DNA 区域常在基因或操纵子编 码顺序的上游，是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的 部位，但启动子本身不被转录。 增强子/沉默子为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻 近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方

5、向无关其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所 调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子负增强子，负调控序列。 核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体 的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。l 转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有 一个 AATAAA 的保守序列，此位点 downstream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加尾信号。回答有人之前提出的一个问题：为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆 时针？时针？

6、那其实是代表两条那其实是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中，它的启动子等在其中 一条链上，而它的抗性基因在另一条链上一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.三、介绍一下关于载体的知识（虽然课本上都有写） 1. 什么是载体 即要把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送 到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体 细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 P.S.基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子，是用来携带目的基因片段进 入受体细胞的 DNA2. 载体的分类 按功能分成： （1

7、）克隆载体都有一个松弛的复制子复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制 扩增。它是用来克隆和扩增 DNA 片段（基因）的载体。（所以有时实验时扩 增效率低下，要注意是不是使用的严谨行载体） （2）表达载体具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）还具有转录/翻 译所必需的 DNA 顺序的载体。按进入受体细胞类型分：（1）原核载体 （2）真核载体（3）穿梭载体 （sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目 的基因（穿梭往返两种生物之间）. P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物 2 个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。3. 基因工程载体的 3 个特点

8、： （一）都能独立自主的复制：载体 DNA 分子中有一段不影响它们扩增的非必 需区域，如 MCS，插在其中的外源 DNA 片段，能被动的跟着载体一起复制/ 扩增，就像载体的正常成分一样。 （二）都能便利的加以检测：如载体的药物抗性基因，多是抗生素抗性基因， 将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时，只有携带这些抗性基因的 载体分子的受体细胞才能存活。 （三）都能容易进入宿主细胞中去，也易从宿主细胞中分离纯化出来。4. 载体的选择和制备：选择载体主要依据构建的目的依据构建的目的，同时要考虑载体中应有应有 合适的限制酶切位点合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合

9、适的表达载体。 载体选择主要考虑下述 3 点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力据克隆片段大小（大选大，小选小）。如 10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞 表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意 3 点： 选择合适的启动子及相应的受体菌； 用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位； 表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。选用质

10、粒（最常用）做载体的 4 点要求： 选分子量小的质粒，即小载体（小载体（11.5kb）不易损坏，在细菌里面拷贝 数也多（也有大载体）； 一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严 谨型质粒10 个。 必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； 必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试） 。无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。 质粒载体 质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的， 与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下： 是染色质

11、外的双链共价闭合环形 DNA（covalently closed circuar DNA,cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在 2-300kb 之间， 15kb 的小质粒比较容易分离纯化，15kb 的大质粒则不易提取。 能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous replicon）。一般 质粒 DNA 复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。 按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制（stringent control）型质 粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有 1 个到十几个拷 贝；另一类是松弛控制（relaxed control）型质粒，其复

12、制宿主不偶联，每个 细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒 DNA 上都有复制的起点，只有 ori 能被 宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状 况主要与复制起点的序列结构相关。有的质粒的可以整合到宿主细胞染色质 DNA 中，随宿主 DNA 复制，称为附加体，例如细菌的性质粒就是一种附加体， 它可以质粒形式存在，也能整合入细菌的 DNA，又能从细菌染色质 DNA 上切 下来。F 因子携带基因编码的蛋白质能使两个细菌间形成纤毛状细管连接的接 合（conjugation），通过这细管遗传物质可在两个细菌间传递。 质粒对宿主生存并不是必需的。这点不同于线粒体，线粒体 DNA 也是环状 双链分子，也有独立复制的调控，但线粒体的功能是细胞生存所必需的。线粒体是细胞的一部分，质粒也往往有其表型，其表现不是宿主生存所必需的，但 也不妨碍宿主的生存。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下 生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏 四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称 R 质粒，带有 R 质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对宿主 不是寄生的，而是共生的。