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1、植物生理学通讯 第45 卷 第3 期，2009 年3 月285收稿2008-12-08修定 2009-02-06资助国家 “863” 重点项目(2008AA10Z114)和中央级公益性科研院所基本科研业务费资助项目。*通讯作者(E-mail: y-; Tel: 0898-66986392)。海藻糖在植物遗传转化中的应用喻时周1,2, 张树珍2, 施宗强3, 蔡文伟2, 罗遵喜2, 杨本鹏2,*1海南大学农学院, 海口 570228; 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室, 海口571101; 3漳州市热带作物气象试验站, 福建漳州363001Applica
2、tions of Trehalose in Plant Genetic TransformationYU Shi-Zhou1,2, ZHANG Shu-Zhen2, SHI Zong-Qiang3, CAI Wen-Wei2, LUO Zun-Xi2, YANG Ben-Peng2,*1College of Agronomy, Hainan University, Haikou 570228, China; 2Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry ofAgriculture, Institute of Tropical
3、Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101,China; 3Tropical Crop Meteorological Station of Zhangzhou City, Zhangzhou, Fujian 363001, China提要: 文章介绍海藻糖的性质、 生理生化功能和海藻糖合酶基因在植物遗传转化中的应用。关键词: 海藻糖; 生物技术; 应用海藻糖(trehalose)是由两分子葡萄糖通过 , -1,1 糖苷键连接而成的非还原性双糖, 最早
4、由Wiggers 在 1832 年研究黑麦的麦角菌时首次发现的, 之后 Mitscherlich在 1858年又从蘑菇中分离出来, 命名为 “ 蘑菇糖 ”(Richards 等 2002; Elbein 等 2003)。它广泛分布于细菌、藻类、酵母、低等植物、昆虫和其它无脊椎动物中。在胁迫条件 下, 它能稳定蛋白质和细胞膜, 特别是在干旱和热胁迫条件下防止蛋白质变性和细胞膜融合(Wingler2002)。它不仅是代谢的应激物, 还是迄今研究得最多的渗透调节剂之一(Penna 2003), 其理化性质、生理功能、作用机制和代谢途径等都有了较为深入的研究。 因此, 采用海藻糖代谢调控提高非生物 胁
5、迫耐受性是最近几年的研究热点。本文介绍海藻糖在植物生理生化中的功能和海藻糖代谢相关的酶基因在植物遗传转化中的应用, 以供这一领域的研究者作参考。1 海藻糖的性质和生物合成1.1 海藻糖的性质 海藻糖为白色晶体, 含有两分子 的结晶水, 熔点为96.597.5 , 比旋光度为+178.3 (20 , 7% 于水中), 它理论上存在 3 种异构体,分别为: ,-1,1- 海藻糖(新海藻糖, neotrehalose)、,-1,1- 海藻糖(异海藻糖, isotrehalose)、-1,1 海藻糖(蘑菇糖, mycose), 但自然界中唯有 ,-1,1 海藻糖以游离态存在(Elbein 等 2003
6、)。其甜味较弱, 能溶于水和热醇中, 不溶于乙醚, 不能还原斐林试剂, 也不被 - 糖苷酶水解, 与氨基酸、蛋白质共 存时, 即使加热也不会产生褐变, 但在强酸条件下能被分解为两分子葡萄糖。它对生物分子的保护机制主要有 3 种学说, 即 “ 水替代 ” 假说(Clegg 等1982)、“ 玻璃态 ” 假说(Hottiger 等 1987)和 “ 优先 排阻 ” 假说(Timasheff 1993)。1.2 海藻糖的生物合成 海藻糖的生物合成主要有 3 种不同的途径, 海藻糖代谢过程中涉及到 2 个关键酶, 即海藻糖 -6- 磷酸合成酶(trehalose-6-phos-phate syntha
7、se, TPS)和海藻糖 -6- 磷酸酶(trehalose-6-phosphate phosphatase, TPP) (De Smet 等 2000)。植物中海藻糖的代谢途径如图 1 所示, TPS 催化UDP-葡萄糖(UDP-glucose)和6-磷酸葡萄糖中的葡 萄糖反应生成6-磷酸海藻糖(trehalose-6-phosphate,Tre6P)和UDP, 6-磷酸海藻糖在TPP作用下生成游离海藻糖和磷酸, 合成的海藻糖在海藻糖酶作用下降解生成两分子的葡萄糖(Elbein 等 2003)。2 海藻糖在植物生理生化中的功能2.1 促进植物的生长发育 Goddijn 和 Smeekens
8、(1998)认为海藻糖在大多数植物中的含量较低或检测不到, 但在自然条件下, 低含量的海藻糖仍然对植物的逆境反应起作用, 同时, 海藻糖和 TPS 对植研究通讯 Research Letter植物生理学通讯 第45 卷 第3 期，2009 年3 月286物的生长发育起调控作用(Paul等2008)。Schluep- mann 等(2004)认为在转基因的拟南芥植株中有 6-磷酸海藻糖积累, 研究表明, 海藻糖对植物体中的糖代谢起调控作用, 还对植物生长发育过程起调节作用。当抑制拟南芥 AtTPS1 基因表达时, 即出现胚致死表型(拟南芥 TPS1 突变体), 说明 AtTPS1 基因在促进胚成
9、熟、根和茎的生长发育和开花诱导 中起作用(Van Dijken 等 2004; Gmez 等 2005)。Avonce 等(2005)认为 ATPS1 基因对野生型植物在葡萄糖和脱落酸中的营养生长起作用。Satoh-Nagasawa等(2006)研究表明, 玉米中的海藻糖能促进玉米花序结构形成。Chary等(2008)认为AtTPS6基因在调控植物细胞形态发生和促进植物花序形成 有关。2.2 提高植物的光合作用 越来越多的证据表明碳代谢对光合作用起调控作用, 海藻糖不仅在植物代谢中起生理作用, 同时, 植物体内的海藻糖积累能 提高植物抵御干旱能力, 还可以提高植物的光合作用(Pellny 等
10、2004)。转入大肠杆菌 otsA 基因的烟 草中, 虽然 6- 磷酸海藻糖含量到达微摩尔水平, 株型矮小、 叶暗绿色, 但其单位叶面积的光合能力增加(Pellny 等 2004)。Pellny 等(2004)通过融合技术将大肠杆菌的otsA和otsB基因转入烟草, 其单位叶面积内的光合速率提高, 从而会改变光合碳代谢的途径, 此过程中积累的是 6- 磷酸海藻糖, 而不是海 藻糖。2.3 调节糖代谢 Mller等(1995)认为在大豆根和结节中有海藻糖积累, 积累的海藻糖对大豆的碳水化合物积累有促进作用, 同时, 大豆根系吸收的海藻糖对大豆的蔗糖代谢也有促进作用。Mller 等(2001)认为
11、大麦叶中果聚糖的生物合成受海藻糖的 制约。拟南芥幼苗子叶和叶中的海藻糖会影响淀粉的生物合成(Fritzius 等 2001)。一般认为海藻糖积累是通过海藻糖酶抑制淀粉和蔗糖的含量而实现的(Mller等2001), 这表明海藻糖在碳分配中起作用(Rolland等 2002)。Wingler等(2002)认为高碳水化合物和高光合速率与海藻糖积累有关, 这说明海 藻糖在糖代谢和碳水化合物代谢中起作用。Garg等(2002)将编码大肠杆菌和酵母菌的海藻糖合成酶 基因转入水稻中, 转基因水稻的抗旱性和抗盐性提高, 而转基因水稻的糖代谢发生改变, 生长和发育不良, 这可能是由于海藻糖干扰了碳水化合物的运输
12、和分配, 也有可能是干扰了正常的植物代谢过程所致。Paul 等(2008)认为 6- 磷酸海藻糖不仅对植物体中的糖代谢起调控作用, 还对植物的生长发育 起调节作用。Chary等(2008)认为 AtTPS1AtTPS4突变体型能促进淀粉的生成, AtTPS5AtTPS11 编码的酶具有海藻糖合酶和磷酸酶活性。3 海藻糖合酶基因在植物遗传转化中的应用在不同生物体中, 编码 TPS 和 TPP 的基因已得到分离, 在酿酒酵母中, 分别命名为 ScTPS 和 ScTPP; 大肠杆菌中, 分别命名为otsA和otsB; 而在其他物种中, 通常指的是 TPS 和 TPP。1893 年在黑曲霉菌(Aspe
13、rgillus niger)中最早发现海藻糖酶; 2年后, 酿酒酵母中也发现海藻糖酶的存在; 后来, 在 甘蔗中也有报道(Glasziou和Gayler 1969)。 到目前为止, 海藻糖合酶基因的分离、 克隆和在植物遗传 转化中的应用已取得一定进展(表 1)。3.1 海藻糖 -6- 磷酸合成酶基因的应用 TPS 是海藻糖生物合成和胁迫耐受响应的关键酶, 海藻糖的积累由于存在内源性磷酸酶, 此酶促使高浓度的6-磷酸海藻糖形成海藻糖( Romer o 等 1 9 9 7 ) 。Holmstrm等(1996)采用农杆菌介导法将酿酒酵母 的TPS基因在拟南芥ats1A基因启动子驱动下导入烟草后, 转
14、基因的烟草抗旱性增强, 据此, 他们认为在渗透调节和干旱胁迫下, 少量海藻糖的积累是为了保护细胞结构和保持大分子的平衡。这理论后来受到质疑, Gaff (1996)认为, 转基因的烟草离体叶片抵御干旱是早期叶气孔细胞关闭引起的, 这说 明TPS基因与植物水分胁迫的耐受性相关。 Serrano等(1999)在CaMV35S启动子驱动下, 烟草中过量表达酵母的TPS基因(TPS1)后, 转基因的烟草中有海藻糖的积累, 表型发生变化, 每克鲜重中含有较低浓度的葡萄糖和蔗糖, 这说明 TPS1 基因的表达可以改变植物的糖代谢, 同时, 转基因的烟草具有一 定的水分胁迫耐受性。Yeo 等(2000)在
15、CaMV35S图1 植物的海藻糖代谢途径(Almeida 等2007a)TPS: 海藻糖 -6- 磷酸合成酶; TPP: 海藻糖 -6- 磷酸酶。植物生理学通讯 第45 卷 第3 期，2009 年3 月287启动子驱动下, 将酵母的TPS1基因导入马铃薯, 转基因的马铃薯水分胁迫耐受性提高。赵恢武等 (2000)在Prd29A启动子驱动下, 将酿酒酵母的TPS基因导入烟草后, 转基因的烟草抗旱性明显增强。Zhang等(2005)将担子菌灰树花的海藻糖合酶基因(TSase)采用农杆菌介导法导入烟草后, 转基因的烟草叶片中有海藻糖的积累, 同时, 转基因的烟草耐旱性和耐盐性增强。Zhang等(20
16、06)将 TSase 基因导入甘蔗后, 转基因的甘蔗耐旱性增强。Avonce等(2005)在CaMV35S启动子的驱动下将AtTPS1基 因导入拟南芥后, 转基因的拟南芥植株中有海藻糖的积累, 其脱水耐受性增强, 形态正常, 转基因的拟南芥幼苗在含有葡萄糖和脱落酸的培养基中生长正常。Almeida 等(2005)在 CaMV35S启动子驱动下,将拟南芥的 AtTPS1 基因和双丙氨膦(Bialaphos, 除草剂)抗性基因插入二元质粒载体 pGreen0229 中,表1 海藻糖合酶基因的分离克隆和在植物遗传转化中的应用基因 来源 启动子 植物 主要功能 参考文献otsA大肠杆菌CaMV35S烟草转基因的烟草叶片中有海藻糖积累。Goddijn 等 1997otsB转基因的烟草叶片较大, 茎较短。Pilon 等 1998转基因的烟草光合作用发生改变, 在干旱胁迫条件下生Pellny 等
