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1、分类号：R 7 7密级：学位类别：科学学位团专业学位口硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N学校代码：1006 2学号：2 0 1 0 6 0 2 5 7 3 学科门类：医学 又肄眚科矢等论文题目：环孢霉素A 对人晶状体上皮细胞抑制的体外研究TIT L EC y c l o s p o r i nAi n h i b i th u m a nl e n se p i t h e l i a lc e l lp r o l i f e r a t i o ni nc u l t u r e一级学科：临床医学二级学科：眼科学论文作者：苗青指导教师：张红
2、教授导师组成员：田芳博士东丽洁博士孙靖博士天津医科大学研究生院二O 一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：益盔日躯，年r 月雩。日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和
3、借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密囹。( 请在相对应的方框内打“”)学位论文作者签名：导师签名：荡舌日疽b 一雌日凇哆年j 月芗。日、年f 只专9E t天津医科大学硕士学位论文目的中文摘要体外研究环孢霉素A ( C s A ) 对人晶状体上皮细胞( H L E B 3 ) 抑制，计算C s A对人晶状体上皮细胞的半数有效抑制浓度；定量测定P C N A 基因在无C s A 处理的对照组与C s A 处理的实验组中的表达，进一步探讨C s A 抑制人晶状体上皮细胞增殖的分子作用机制，验证C s A 与P C N A 阳性
4、细胞表达量的关系，为C s A 修饰的I O L 体内实验提供依据。方法体外培养来源于广州中山医科大学眼科中心的人晶状体上皮细胞株H L EB 3 细胞。( 1 ) 细胞增殖实验的测定观察细胞增殖状态，实验设置1 0 个细胞浓度梯度( 0 1 2 5 1 0 4 个m l 、0 2 5 1 0 4 个m l 、0 5 1 0 4 个m l 、1 0 1 0 4 个m l 、1 5 1 0 4 个m l 、2 0 1 0 4个m l 、2 5 1 0 4 个m l 、3 0 1 0 4 个m l 、3 5 1 0 4 个m l 、4 0 1 0 4 个m 1 ) 。以2 1 0 4 个m l细胞
5、密度种植9 6 孔板，设置实验组与对照组，实验组给予C s A 刺激，浓度为l u g m l 、2 u g m l 、4 u g m l 、8 u g m l 、1 6 u g m l ，作用时间2 4 h 、4 8 h 、7 2 h ，对照组无C s A 刺激，作用时间2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 。每组设2 个平行复孔，重复3 次。( 2 ) P C N A 基因的表达测定以1 1 0 5 个m l 的细胞密度接种于2 4 孔板，实验组给予C s A刺激，浓度l u g m l ，作用2 4 h 、4 8 h ，对照组无C s A 刺激，应用R T - P C R 检测P C
6、N A基因的复制；应用组织免疫学方法检测P C N A 阳性细胞的表达。每组设2 个平行复孔，重复3 次。( 3 ) R T - P C R 结果应用2 - Z X Z X C T 统计量进行分析，免疫组织化学结果分别应用P I ) 及I P P 5 0图像分析法。所有统计学数据，应用S P S S l 9 0 进行统计学分析，检验水准a = 0 0 5 。结果( 1 )在低浓度时( 1 u g m 1 ) C s A 作用2 4 h 对人晶状体上皮细胞的增殖抑制实验组与对照组差异不具有统计学意义( 尸 0 0 5 ) ，作用4 8 h 对细胞增殖抑制实验组与对照组差异具有统计学意义( 尸 0
7、 0 5 ) ，t h er o l eo f4 8hc e l lp r o l i f e r a t i o ni n h i b i t i o no ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o lg r o u pd i f f e r e n c e ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ( P O 0 5 ) ，t h er o l eo f4 8hP C N Ae x p r e s s i o nq u a n t i t yo ft h ee x p
8、e r i m e n t a lg r o u pa n dc o n t r o lg r o u pd i f f e r e n c e ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tr P O 0 5 ) ；R o l eo f4 8hd i f f e r e n c eh a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e 伊 0 0 5 P 4 0 u m o l L时，这种保护作用减弱，当C s A 浓度 8 0 u m o V L 时，将加重细胞损伤( 实验条件，先将不同浓度C s
9、A 作用于晶状体上皮细胞3 0 m i r a ，然后将经处理后晶状体上皮细胞暴露于H 2 0 2 损伤中2 h ) 。我们在实验的第二部分中发现，C s A l u g m l 作用4 8 h 后P C N A 的表达减少，而研究发现P C N A 可以通过P 5 3 途径，促进细胞凋亡。上述两种途径作用于细胞凋亡过程，而作为免疫抑制剂的C s A 其免疫抑制作用在淋巴细胞活化后数小时内发挥作用。我们认为这可能是在短时间内( 2 4 h ) C s A 对H L E B 3 细胞增殖不具有抑制作用，但延长药物作用时间将表现出C s A 通多抑制P C N A 基因的表达，进而抑制P C N
10、A 蛋白的合成，通过P 5 3 途径，促进H L E B 3 细胞的凋亡。同样表现为抑制晶状体上皮细胞的增殖。也再次验证，残余晶状体上皮细胞的增殖是产生后发性白内障原因之一。天津医科大学硕士学位论文二、P C N A 在经过C s A 处理后的H L E B 一3 细胞中的表达综上，正是由于C s A 对晶状体上皮细胞作用所表现出的多样性，进一步证明了，作为免疫抑制剂的C s A 对细胞作用信号转导的多通路性。在此过程中，那种作用通路表现为优势通路，则细胞的生存状体将有所不同。我们研究的目的，是寻求合适和C s A 浓度，作用与术后白内障患者眼内，持续一定时间，防治后发性白内障的形成。实验表明
11、，C s Al u g m l 连续作用4 8 h ，能够有效抑制人晶状体上皮细胞的增殖。使环孢霉素A 作为眼内抑制后发性白内障的药物，成为可能。该浓度下是否对眼内组织细胞产生毒性作用，将在以后的动物实验中进一步研究。2 4 小结( 1 )R T - P C R 检测，经过C s A 处理的H L E B 3 细胞的P C N A 基因表达与未经C s A 处理组的差异具有统计学意义。( 2 )免疫组化检测表明，在经过C s A ( 1 u m 1 ) 处理的H L E B 32 4 h 后细胞核中的P C N A 蛋白的表达与未经过C s A 处理组差异不具有统计学意义，4 8 h细胞核中的
12、P C N A 的表达与未处理组的差异具有统计学意义。综上，环孢霉素A 能够抑制P C N A 的表达，且呈浓度依赖性，环孢霉素A 能够抑制人晶状体上皮细胞的增殖，其最小有效抑制浓度为l u g m l 。2 7天津医科大学硕士学位论文结论结论1 环孢霉素A 对人晶状体上皮细胞抑制的最小有效浓度为l u g m l 作用4 8 小时。C s A l u g m l 作用2 4 小时，对H L E B 3 细胞的抑制无明显作用，C s A 对H L E B 3 细胞的抑制呈现时间依赖性及浓度依赖性。2 环孢霉素A 抑制晶状体上皮细胞的作用机制与抑制P C N A 表达相关，再次说明，晶状体上皮细
13、胞的增殖为导致后发性白内障原因之一。3 环孢霉素A 对H L E B 3 细胞作用的多样性反应了C s A 作用免疫抑制剂对细胞事件作用机制的多元性。综上：较低浓度的环孢霉素A ( 1 u g m 1 ) 作用足够长的时间能够抑制人晶状体上皮细胞的增殖，使其成为抑制后发性白内障有效药物成为可能天津医科大学硕士学位论文参考文献参考文献【1 P r o s d o c i m oGT a s s i n a r iGS a l aM ，e ta 1 P o s t e r i o rc a p s u l eo p a c i f i c a t i o na f t e rp h a c o e
14、 m u l s i f i c a t i o n ：s i l i c o n eC e e O nE d g ev e r s u sa c r y l a t eA c r y S o fi n t r a o c u l a rl e n s J C a t a r a c tR e f r a c tS u r g ，2 0 0 3 ；2 9 ( 8 ) ：1 5 5 1 - 5 2 L o i sN ，D a w s o nR ，M c K i n n o nA D ，e ta 1 An e wm o d e lo fp o s t e r i o rc a p u s u l
15、eo p a c i f i c a t i o ni nr o d e n t s 【J I n v e s tO p h t h a l m o lV i sS i c ，2 0 0 3 ，4 4 ( 8 ) ：3 4 5 0 3 】A w a s t h iN ，W a f n e rB J S u p p r e s s i o no fh u m a nl e n se p i t h e l i a lc e l lp r o l i f e r a t i o nb yp r o t e a s o m ei n h i b i t i o n J I n v e s tO p
16、h t h a l m o lV i sS i c ，2 0 0 6 ；4 7 ( 10 ) ：4 4 8 2 9 4 4P a n d e yS k ，A p p l eD J ，W e m e rL ，e ta 1 P o s t e r i o rc a p s u l eo p a c i f i c a t i o n ：Ar e v i e wo ft h ee a t i o p a t h o g e n e s i s ，e x p e r i m e n t a la n dc l i n i c a ls t u d i e sa n df a c t e r sf o rp r e v e n t i o n 川I n d i a nJO p h t h a l m o l2 0 0 4 ；5 3 ( 2 ) ：9 9 - 1 12
