高效液相色谱技术及应用

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1、高效液相色谱技术及应用高效液相色谱技术及应用高效液相色谱技术及应用高效液相色谱技术及应用生命试验中心 何 海 辉 Tel:3607335概述概述高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法一、一、历史历史二二、高效液相色谱仪流程图高效液相色谱仪流程图三、特点三、特点历史历史历史历史1906年 俄国植物学家Tsweet创立色谱法 30年代 茨维特分离绿叶色素 40年代TLC，纸色谱 50年代 GC出现使色谱具备分离和在线分析功能 60年代末 HPLC出现，使色谱分析范围

2、进一步扩 大1960现在现在高效液相色谱仪与质谱仪器的联用是一 个重要的发展方向。2004年推出的超高效液相色谱 （UPLC)技术。液相色谱技术的发展1960-20040000 s s19591959 GPC - Dow Columns & Waters instrumentation 19671967 Waters 1st HPLC6060 s s7070 s s19721972 M6000 HPLC Pump8080 s s9090 s s19961996 Alliance 19991999 Hybrid particle XTerraFast HPLCHigh Performance L

3、iquid ChromatographyIncreasing Refinement & Consistency超高效液相色谱超高效液相色谱2004 (ACQUITY2004 (ACQUITYUPLC)UPLC) Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图二、高效液相色谱仪流程图1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输

4、液泵） 3 3进样装置进样装置进样装置进样装置 4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分离分离分离分离 5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析 6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置续前续前三、三、HPLC的特点和应用的特点和应用“三高三高” “一快一快” “一广一广”高柱效高柱效n=10n=104 4片片/ /米，柱效高（远高于一般米，柱效高（远高于一般LCLC） 高灵敏度高灵敏度 高选择性高选择性 分析速度快分析速度快 应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%80%有机化合物）有机化合物）基本理论

5、和条件选择基本理论和条件选择基本理论和条件选择基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论平衡理论平衡理论基础基础 动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论VanderVander方程方程一、塔板理论 二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择塔板数是反映色谱柱及仪 器性能状态的关键参数塔板数是反映色谱柱及仪 器性能状态的关键参数A A12,00012,0007,0007,000相同色谱柱相同色谱柱仪器仪器A： 谱带展宽较小（谱带展宽较小（70L） 测出的塔板数较高（测出的塔板数较高（12,000）仪器仪器B： 谱带展宽较大（谱带展宽较大（130L） 测出的塔板数较低（测出的塔

6、板数较低（7,000）B B塔板数：柱效测定结果各类高效液相色谱法的分类各类高效液相色谱法的分类各类高效液相色谱法的分类各类高效液相色谱法的分类一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（BPC）高效液相色谱仪高效液相色谱仪高效液相色谱仪仪器构成高效液相色谱仪仪器构成1泵： 往复式恒流泵 高压磁力泵 2进样装置 1）阀进样：手动进样，六通阀 2）泵进样：自动进样，体积无限制 3）机械手进样：自动控制，批量分析3色谱柱：分析型：直径46mm,柱长1030cm 制备型：直径1050mm,柱长30100cm柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4检测器1）紫外检测器：适

7、于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质， 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光 6）其他检测器：质谱检测器，核磁共振检测 器，光电二极管阵列检测器日常日常HPLC分析工作中所面临的常见问题分析工作中所面临的常见问题Peak TailingRetention ReproducibilityProduct Quality PriceWatersPeak TailingRetention Reproducibility峰拖尾: 28%保留时间不重现: 25%分离不佳分离不佳: 24%柱寿命太短 11%极性化合物保

8、留不佳: 12%合理的逻辑判断 合理的逻辑判断 将会节省解决问题的时间将会节省解决问题的时间色谱问题的可能根源?流动相?进样器?在线过滤器?色谱柱?检测器?样品?泵?保护柱?连接管线及接头?积分仪/记录仪/软件填装良好的色谱柱在系统、连接状况 皆良好的状况下，色谱峰形很好填装良好的色谱柱在系统、连接状况 皆良好的状况下，色谱峰形很好良好的色谱结果pH带来的保留与选择性变化带来的保留与选择性变化?化合物从离子化状态变化到非离子化 状态其保留因子变化化合物从离子化状态变化到非离子化 状态其保留因子变化10 到到 30倍倍?上述变化相当于有机溶剂的比例变 化上述变化相当于有机溶剂的比例变 化20%

9、?pH带来最显著的选择性变化带来最显著的选择性变化?pH是方法开发最强有力的选择性调节 工具是方法开发最强有力的选择性调节 工具051015202530350123456789101112pH容量因子 (k)酸性物质未电离酸离子化的酸 2 2 pH 单位 = 99% 未离子化+ 2 pH单位= 99% 离子化pKa 2 pH 单位以外可获得更稳 定的保留单位以外可获得更稳 定的保留 (重现性更好重现性更好)稳定区域：方法稳定性更好谱带展宽体积与系统体积死体积死体积死体积死体积/ / / /谱带展宽体谱带展宽体谱带展宽体谱带展宽体 积，包括：进样器、管积，包括：进样器、管积，包括：进样器、管积，

10、包括：进样器、管 路及检测池路及检测池路及检测池路及检测池溶剂输送 系统(泵) 检测器进样器色谱柱色谱柱梯度混合器溶剂输送 系统(泵)高压梯度滞后(系统)体积滞后(系统)体积注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！比例阀检测器进样器ABC D色谱柱色谱柱溶剂输送 系统(泵)低压梯度阻尼器混合器40 minutes1234 512345InitialAfter failure1. 尿嘧啶 2. 心得安 3. 萘 4. 苊 5. 阿米替林C18色谱柱的典型谱图高效液相色谱仪的应用1。有利于分离热不稳定和非挥发性的、离 解的和非离解的以及各

11、种分子量范围的 物质。2。 能够分离复杂相体中的微量成分。随 着固定相的发展，有可能在充分保持生 化物质活性的条件下完成其分离。?由于高效液相色谱法具有上述各种特 点，因而广泛应用与核酸，肽类，稠环 芳烃，高聚物，药物，人体代谢物，生 物大分子，表面活性剂，抗氧剂，杀虫 剂等的分析。?总的来说，高效液相色谱法非常广泛的 应用于医药，生化，天然产物主要组分 的分析，以及食品分析，环境分析，农 业分析，石油化工分析。医药方面医药方面?可以了解监控药物生产过程中主体和副 体产物的存在情况。另外通过测定人体 血或尿中药物的含量分析药物在体内的 代谢情况也是近来医药研究的主要内容 之一。生化方面生化方面

12、?高效液相色谱法在生化方面的研究主要 体现在对RNA,DNA及其碎片的研究，对 氨基酸，肽和蛋白质的分析，以及对酶 和糖的分析天然产物天然产物?天然产物的组分非常复杂，例如中草药 等，用高效液相色谱法进行分离分析， 具有简单快速的特点。食品方面食品方面?有效分析控制食品或饲料中各种添加剂 及有害有毒成分，是当前食品科学中的 重要课题，高效液相色谱法已经被广泛 应用于这些领域。环境分析环境分析?在对大气中污染物的成分分析，废水， 废汽和汽车尾气中有害组分的分析中， 高效液相色谱法发挥着很大的作用农业分析农业分析?在农业的发展中，高效液相色谱也发挥 着很大的作用。它主要用来对各种农作 物中营养成分

13、进行分析，特别是对多 糖，脂肪酸，蛋白质等分析都是极为有 效的方法。例1 氨基酸分析AU-0.050.000.050.100.150.200.250.300.350.40?15.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0050.0055.0060.0065.0017.257 18.15019.71220.22420.43822.04223.12824.999例2 雌二醇，雌酮分析AU0.00000.00050.00100.00150.00200.00250.00300.00350.00400.00450.00500.00550.00600.00650.00700.00750.0080? ?0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.00中心现有中心现有中心现有仪器中心现有仪器Waters600 HPLC 变性高效液相色谱仪变性高效液相色谱仪(dHPLC)快速液相色谱仪快速液相色谱仪(FPLC)KTATMexplorer100 快速纯化工艺开拓系统快速纯化工艺开拓系统