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1、实验一：大肠杆菌实验一：大肠杆菌 DH5DH5 和和 BL21BL21 感受态细胞的制备感受态细胞的制备 【实验步骤】 1 从 LB 平板上挑取新活化的大肠杆菌 DH5 单菌落，接种到 5mL LB 培养基中，37 振荡培养过夜。 2 取 1mL 培养物接种到 100mL LB 培养基（250mL 三角瓶）中，37振荡培养 23h。 3 将菌液转移到 50mL 离心管（2 管）中，冰上放置 15min。4 4 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液，倒置使培养液流尽。 5 用 20 mL 冷 CaCl2溶液悬浮菌体沉淀合并成一管，在 4 4000 rpm 离心 5min，弃去 上清液。
2、6 用 10 mL 冷 CaCl2溶液悬浮菌体沉淀，冰浴 30min。7 4 4000 rpm 离心 5min，弃去上清液，用 2 mL 的冷 CaCl2溶液悬浮。 8 分装到数个 EP 管中，每管 200 uL，冷冻保存备用。 实验二：目的基因质粒（实验二：目的基因质粒（T-SODT-SOD 或或 T-IL218T-IL218） 和表达载体质粒（和表达载体质粒（PET32PET32 或或 PET30PET30）的转化及大量提取）的转化及大量提取 【实验步骤】 一、载体的转化（无菌条件，冰上进行） 1、取 200 uL 新鲜制备的感受态细胞，分别加入质粒 DNA 2 uL（PET32a，IL-
3、18），混 匀，冰上放置 30min。 2、将 EP 管放到 42 保温 90s，冰浴 2min。 3、加入 800uL LB 液体培养基，37慢摇复苏 1 h。 4、将 100 uL 的复苏细胞涂布在含有 Amp（100mg/mL）的 LB 培养皿中，正置平皿 30min（使菌液被培养基吸收）。 5、倒置平皿 37培养 16 h，出现菌落。 二、质粒的提取 1 挑取单菌落接种于 100 mL 加入 50uL Amp 的 LB 液体培养基中，振荡培养过夜。 2 过夜培养的菌液加入 1.5 mL 的小指管（20 个每组）中，每次 1 mL，4，12000 rpm，离心 1min，4 次，弃上清。
4、 3 加入 150uL 溶液悬浮细胞，漩涡振荡，室温静置 10min。 4 加入 350uL 溶液（新鲜配制），轻微颠倒混匀 20 次，冰浴 5min。（不能再剧烈震 荡） 5 加入 300uL 溶液（冰上预冷），颠倒混匀 20 次，不能剧烈震荡，冰浴 10min。 6 4，12000 rpm，离心 10 min，取上清转移至另一离心管中。 7 向上清中加入 0.6 倍异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20 min。 8 4，12000 rpm，离心 10 min，弃上清，倒扣于吸水纸上，吸净液体。 9 用 1mL 70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀 2 次，每次 4，12000 rpm，离心 3mi
5、n，吸去上清。10 55烘干至无酒精，加入 20uL TE，所有集成一管后加入 RNase 12uL，37消化 12h，-20保存。 11 电泳分析。制胶：0.14g 琼脂糖，20mL 1TBE 缓冲液，溶解后倒入制胶板，放入梳 子，冷却凝固待用。点样：6uL 质粒+1uL 上样缓冲液。电压：180V，电泳至蓝色带距离点 样孔 3cm。 实验三实验三 目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化目的基因质粒和表达载体质粒的酶切及其产物的分离纯化 【实验步骤】 1 酶切酶切体系试剂 小量酶切 大量酶切 灭菌水 5uL 质粒 10uL 88uLEcoR 0.5uL 1uL Hind 0.5u
6、L 1uL 10Tango buffer 4uL 10uL 终体积 20uL 100uL按以上酶切体系加入 0.5 mL EP 管中，37放置 3h，电泳回收片段。 （点样：酶切体系 100uL+上样缓冲液 20uL。 ） 2 酶切产物的回收 1)将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分放入干净的离心管 中，称取重量。 2)向胶块中加入 3 倍体积溶胶液（如果凝胶重为 0.1g，其体积可视为 100uL，则加入 300uL 溶胶液） ，50-55水浴放置 10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶 块充分溶解。 注意：溶胶时，如果溶胶液变为红色（正常情况下为淡黄色
7、） ，可向含有 DNA 的胶溶液中 加 10-30uL 3N 醋酸钠（pH5.2）将溶液调为淡黄色，否则将会影响 DNA 与吸附柱的结合， 影响回收效果。 3)将上一步所得的溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中） ，13，000rpm 离心 30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。 注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合 DNA 的能力较弱。 4)向吸附柱中加入 700uL 漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇） ，13，000rpm 离心 30-60s，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。 5)向吸附柱中加入 500uL 漂
8、洗液，13，000rpm 离心 30-60s，倒掉废液。 6)将离心吸附柱放回收集管中，13，000rpm 离心 2min，尽量出去漂洗液，将吸附柱开 盖于室温 1-2min，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。 7)将吸附柱放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量 65-70预热的 洗脱液，室温放置 2min。13，000rpm 离心 2min 收集 DNA 溶液。 8)DNA 产物-20保存。 完毕后电泳检测回收与纯化效果：DNA 回收纯化后，电泳检测应为单一的一条带，如果切 胶过程中不慎带上染带，回收后电泳结果可能会出现两条以上的带，这时应重复上述方法 进行回收与纯化
9、。 实验四实验四 目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定目的基因与表达载体的重组及重组子的筛选与鉴定 【实验步骤】 1 载体与目的基因的连接 1)在一 1.5mL EP 管中加入 2uL 酶切后的载体 DNA 与 6uL 目的 DNA 片段。 2)添加 1uL 的 10buffer 以及 1uL 的 T4DNA 连接酶，总体积 10uL。3)16水浴条件下保温过夜连接。 2 感受态细胞与连接产物的转化 1)取感受态细胞 BL21（实验一制备） 200uL，加入 6uL 连接产物，轻轻用枪吹打混匀 （不可震荡） 。 2)冰浴 30min。3)热激：42保温 90S，冰浴 2min。 4)加
10、入 800ul LB 培养基，37慢慢复苏 30min。 5)将复苏菌液 4000r/min 离心 1min，先吸去 800L 上清，再将细胞吹散成细胞悬液， 取 50L 细胞悬液直接涂布在含氨苄青霉素（Amp）100ug/ml、X-gal 和 IPTG 的 LB 选择平板上。 6)将平板正向放置 30min 左右至液体被吸收，倒置平板 37培养 1620h 出现菌落，其 中白色为重组质粒。3 重组子的鉴定（蓝白斑筛选，小提质粒比大小和酶切分析） 1）将白色单菌落接入 3mL 含抗生素（Amp）的 LB 液体培养基中，37振荡培养过夜。 2）按实验二的方法提取质粒 DNA，20uL RTE 溶
11、解 DNA 沉淀。 3）双酶切质粒 DNA 20uL 体系，方法同上。 4）1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒和它的酶切产物。 （酶切鉴定重组子可见重组成功的重组子有两个条带：一为切为线性的 PET32a 质粒条带， 一为目的基因条带。 ） 实验五实验五 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的目的基因在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的 SDS-PAGESDS-PAGE 分析分析 实验 I 、外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 【实验步骤】 1. 分别挑取白斑菌落（重组菌株） 、蓝斑菌落（非重组菌株）于 5ml 含 AMP 的 LB 液体培 养基中，37，190r/min 振荡培养过夜(注意取菌株要
12、在超静工作台上操作，一定注意无 菌)。 2.分别取过夜培养菌 1ml 接种到 5ml 含 AMP 的 LB 液体培养基中（蓝，白斑各 3 管，作好标 记） ，于 37摇床培养 4h 左右，达到 1 个 OD 值。 3.因为诱导剂 IPTG 的量,诱导条件,诱导时间，培养基成分都可影响诱导表达，所以可按如 下 6 组设计培养摇瓶时间（t/h）IPTG/ul温度 T/ 样液5732白5737白5742白5732蓝5737蓝5742蓝4.分别取 6 支试管按上述表格控制条件,摇瓶培养 5h。 5. 取 1ml 摇瓶后菌液于离心管，共 6 支，4低温离心，12000 r/min，5 min，收获菌体，
13、 弃上清，取沉淀（菌体可放-20存放备用） 。 6.向每支试管沉淀均加入 200L TE 液，将细胞悬浮。 7. 每管加入 200L 2 X SDS buffer。开水煮沸 5min，再冰浴 2min，4,12000 r/min，5 min，取上清液做凝胶电泳。 8.观测结果及分析（实验） 。 实验 SDS-PAGE 检测表达蛋白 【实验步骤】 1 配制分离胶 分离胶配方双蒸水分离胶缓冲 液30%胶贮液10%SDSTEMED10%AP6.7ML5ML8ML200L15L150L按要求装好胶板 按比例调好分离胶，混匀后加入两玻璃夹缝中，到上口约2cm处，并小心在胶面上加入 1cm 蒸馏水，约 4
14、0 min，等胶自然凝聚后倾斜倒，出蒸馏水，并在两玻璃板夹缝中水平插 入 1.5 mm 的梳子(在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入， 影响凝胶)。2.按配方配制好浓缩胶浓缩胶配方 双蒸水浓缩胶缓冲 液胶贮液10%SDSTEMED10%AP6.1ML2.5ML1.3ML100L15L75L混匀后加入到分离胶上，并没过梳子，待凝固后小心拨出梳子。 3样品制备菌体样品与 2上样缓冲液 l:1 混匀，并在 100C 沸水浴中保温 3-5 min，取出待用。4.点样，电泳：开始电泳后，先恒压80V，样品进入分离胶后恒压120V，至电泳带跑到前沿后停止电泳。5.固定、染色、脱色：电泳完毕，将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶浸泡于染色液中染色30min左右，最后加脱色液放到脱色摇床上脱色至区带清晰为止。
