盐析法纯化免疫球蛋白

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1、盐析法纯化免疫球蛋白盐析法纯化免疫球蛋白2008-07-11 01:04:03 相关论文 相关书籍Tags：盐析法盐析法 纯化纯化 生物化学生物化学 盐析法纯化免疫球蛋白盐析法纯化免疫球蛋白 (一) 原理 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。(二) 主要材料1. 试剂:(1) 正常人混合血清；灭菌生

2、理盐水。(2) 饱和硫酸铵溶液的配制:称(NH4)2SO4(AR)400425 克，以 5080之蒸馏水 500ml 溶解，搅拌 20 分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水(15N NH4OH)调 PH 至 7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。(3) 萘氏试剂配制：称 HgI 11.5 克，KI8 克，加蒸馏水至 50ml，搅拌溶解后，再加入 20NaOH 50ml。(4) 0.02M, PH7.4 磷酸盐缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline PBS)配制:贮存液:A 液：0.2M Na2HPO4：Na2HPO412H2O 71.64 克，加蒸馏水至 1000ml；

3、B 液: 0.2M NaH2P4：NaH2P42HO 3.12 克，加蒸馏水至 1000ml；应用液：取 A 液 81ml 加 B 液 19ml 混合，再以生理盐水作 10 倍稀释即成。(5) 0.1M, PH7.4 磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer PB)配制:将上述 A 液取 81ml 与 B 液 19ml 混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。(6) 20磺基水杨酸。2. 器材:普通冰箱、离心机、电磁搅拌器，751 桮型紫外分光光度计、扭力天平，粗天平。透析袋、尼龙绳、细竹棒、精密 PH 试纸(PH5.59.0)、眼科镊子、小剪刀。烧杯、量筒、吸管、滴管、灭菌小瓶、试管等。(三)

4、盐析的操作步骤取正常人混合血清加等量生理盐水，于搅拌下逐滴加入与稀释血清等量的饱和硫酸铵终浓度为 50饱和(NH4)2SO4 4，3 小时以上，使其充分沉淀离心(3000rpm), 20 分钟，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至 Xml。再逐滴加饱和硫酸铵/ml置 4，3 小时以上此时(NH4）2SO4的饱和度为 33)重复上述第二步过程 1?次。将末次离心后所得沉淀物以 0.02M PH7.4 PBS 溶解至 Xml 装入透析袋。对 PBS 充分透析、除盐换液 3 次，至萘氏试剂测透析外液为无黄色将透析袋内样品取少许作适当倍数稀释后，以 751-G 紫外分光光计测蛋白含量。方法如下:蛋白含量(mg

5、ml)(1.45OD280nm-0.74OD260nm)样品稀释度。注：式中 1.45 与 0.74 为常数，nm 为波长。(四) 影响盐析的因素1. 蛋白质的浓度：盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。2. 离子强度:各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为 50时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为 33时 球蛋白析出。3. 盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。4. PH 值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变 PH 改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。5. 温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于 25时较0更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。6. 蛋白质沉淀后宜在 4放 3 小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。