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1、 基于化学指纹图谱的绿茶原料品种判别分析摘要：【目的】探索化学指纹图谱在建立绿茶原料品种属性鉴别验证技术方面应用的可行性与潜力。 【方法】利用 HPLC 和信息融合原理，按单一产地和混合产地两种原则，建立根据不同原料品种分组的绿茶样本的多元数字化化学指纹图谱，并采用逐步判别分析技术进行样本的分类判别研究和验证。 【结果】采用杭州西湖区、绍兴新昌县和丽水莲都区共 3 个产地的样本各自建立的单一产地判别函数，其回判正确率、交叉验证正确率和外部验证正确率均为 100%；采用 8 市（县）混合样本建立的判别函数，其回判正确率为 99.2%，交叉验证成功率为 97.7%，外部验证正确率为 100%。 【
2、结论】HPLC 建立的绿茶多元化学指纹图谱能够较好地表征茶叶样本的品种属性，在此基础上有望建立一种对茶产品原料品种的判别验证技术。关键词：绿茶；化学指纹图谱；判别分析；品种Discriminant Classification of Green Teas Raw Material Cultivar Based on Multiple Chemical FingerprintCHENG Hao, WANG Li-yuan, ZHOU Jian, LIU Xu, YE Yang, LU Wen-yuan(Tea Research Institute, Chinese Academy of Agri
3、cultural Sciences/National Center for Tea Improvement, Hangzhou 310008)Abstract: 【Objective】The present study was set to develop a method for validating raw material cultivar using multiple chemical fingerprint.【Method】The multiple digital chemical fingerprints of green tea samples were established
4、by jointing two HPLC chromatograms. Stepwise discriminant analysis was done using SPSS software in two ways of using samples from single producing area and from mixed areas respectively.【Result】When discriminant functions were established using samples from single producing area, the recognition acc
5、uracies of training, testing and cross-validating were all 100%. When using mixed area samples, the recognition accuracy of training was 99.2%, that of cross-validating was 97.7% and that of testing was 100%.【Conclusion】The multiple chemical fingerprints established could figured the raw material cu
6、ltivar attributes of green tea samples properly. So it is promising to develop a kind of raw material cultivar validation method of green teas by applying this method.Key words: Green tea; Chemical fingerprint; Discriminant analysis; Cultivar0 引言【研究意义】目前，龙井茶一类的历史传统名茶大多已申请了原产地保护，但由于缺少足够的技术支撑，目前的保护措施还
7、只停留在发证、发标签等行政式的管理手段上。由于品种适制性等原因，这类传统名茶的品质往往与其原料的品种关系密切，不同品种制作的产品往往会有较大的品质差异，从而对其经济价值也产生较大的影响。因此，对名茶制作原料提出品种要求必将成为今后产品控制的发展方向，但目前缺乏对产品原料品种的验证鉴别技术。化学指纹图谱技术是一种在其它学科领域已有成功应用范例的新技 术1,2，如在中药现代化研究中用于评价药材的道地性和品质等。判别分析技术近来也在许多经济作物的品质与类别鉴定研究中取得了较好效果3,4。因此，在茶学研究中引入这些技术对于绿茶产品的鉴别验证研究具有重要意义。【前人研究进展】在茶叶研究方面，早期的研究主
8、要集中在茶叶内含品质成分的同步测定技术上5,6，在此基础上，之后的一些研究开始试图分析不同茶产品中内含成分随产品种类的变化7,8，但由于其复杂性，均只能得到一些定性的描述。其后，化学指纹图谱在茶叶上的应用研究进入起步阶段。如罗一帆等9采用近红外光谱进行了茶叶中茶多酚和茶多糖的预测模型建立研究。何昱等10对 33 批茶多酚进行了高效液相色谱指纹图谱分析，制作了数字化的特征指纹谱，认为其可以应用于茶多酚产品的质量控2414 中 国 农 业 科 学41 卷制方面。陈全胜等11采用近红外光谱进行了龙井、碧螺春、祁红和铁观音 4 类茶叶产品的识别与分类研究。陈波等12进行了茶叶的1HNMR 指纹图谱研究
9、，对不同产区的铁观音进行了初步区分。Li 等13对茶软饮料进行了近红外化学指纹图谱分析。Pedro 等14采用 HPLC 分析法对肯尼亚、印度、日本等国家以及中国云南的普洱茶、福建的乌龙茶等进行了产地区分的判别研究。Borse 等15研究了印度不同地区所产红茶的指纹图谱，分析了不同产区产品在成分组成上的差异。【本研究切入点】本文利用 HPLC 建立不同茶样的多元数字化化学指纹图谱，按单一产地与混合产地两种原则，根据原料品种对样本分组建立模式图谱，采用判别分析方法进行样本的分类研究。【拟解决的关键问题】以此探索化学指纹图谱在绿茶原料品种验证判别等方面应用的可行性与途径。1 材料与方法1.1 材料
10、试验采用样本材料 146 个，取样时间为 2006 年春茶季节和 2007 年春茶季节，取样地点为杭州市西湖区、建德市、金华市武义县、绍兴市新昌县、丽水市莲都区、松阳县、遂昌县、缙云县，样本的原料品种来源为龙井 43、迎霜和群体种。单一产地样本的品种判别试验共分 3 组，分别采用杭州市西湖区、绍兴市新昌县和丽水市莲都区的样本，每组每品种样本随机留出 23 个样本作为验证 样本。混合产地样本的品种判别试验采用以上所有样本，采用的验证样本与单一产地样本品种判别试验相同。1.2 方法 1.2.1 样本制备与分析 干茶样粉碎后，每样本称取 3.000 g，50%乙醇室温浸提 15 min，过滤，滤渣洗
11、涤 3 次后合并滤液，冷却并定容至 100 ml。0.22 m 滤膜过滤后，Agilent 1100 系列高效液相色谱（Phenomenex RP-MAX 4 m，250 mm4.6 mm，C12 反相柱，柱温 40 ）分别按以下两色谱条件分离分析：（1）色谱条件 1：A 相为 1%甲酸；B相为乙腈；梯度从 4% B 到 25% B，流速 1 mlmin-1，60 min，检测波长 280 nm；（2）色谱条件 2：A相为 1%甲酸；B 相为乙腈；梯度从 10% B 到30%B，流速 1 mlmin-1，60 min，检测波长 365 nm16。1.2.2 指纹图谱建立的方法学考察 用同一份样
12、本，进续进样 5 次，进行精密度考查。用同一样本，分别在制备后 1、2、4、12 和 24 h 进样（室温放置），进行稳定性考查。用同一份茶样平行制备 5 个样本，分别进样分析，进行重复性考查。 1.2.3 数字化多元化学指纹图谱建立 每样本的两色谱图分别以峰面积相对最大之主峰为参照，计算相对保留时间和相对峰面积；各峰按相对保留时间一一匹配后，选择 90%以上样品中存在的峰为样本集的共有峰，以多元信息融合原理将两色谱图以串行方式进行象素级融合1719，最终选择采用 41 个色谱峰数据建立起各样本的数字化多元化学指纹图谱20。 1.2.4 判别分析 采用 SPSS 软件，按统计量 Wilks 最
13、小值原则选择变量，进行逐步判别分析，建立判别方程。然后进行训练样本的回代判别，计算回代错判率，并将每一样本逐一从训练集中去掉，再按同样方法判别分析，进行内部交叉验证分析，验证所建立方程的稳定性。最后采用外部验证样本验证判别方程的判别效果。2 结果与分析2.1 化学指纹图谱建立的色谱分析精密度考查结果表明，色谱方法 1 的保留时间RDS 在 0.436%0.896%，峰面积 RSD 在0.695%5.218%；色谱方法 2 的保留时间 RDS 在0.014%0.033%，峰面积 RSD 在 1.062%4.859%。稳定性考查的结果表明，色谱方法 1 的保留时间RSD 在 0.836%1.753
14、%，峰面积 RSD 在0.445%7.985%；色谱方法 2 的保留时间 RSD 在0.289%0.446%，峰面积 RSD 在 0.698%6.582%。重复性考查的结果表明，色谱方法 1 的保留时间RSD 在 0.236%0.813%，峰面积 RSD 在2.347%3.345%；色谱方法 2 的保留时间 RSD 在0.163%0.224%，峰面积 RSD 在 1.520%2.829%。两种色谱方法的方法学考察表明，采用的色谱方法均有较好的精密性、稳定性和重复性，可保证后继研究工作能够得到精密和稳定的数据。2.2 同一产地样本的品种来源判别采用 1.2.3 方法建立的化学指纹图谱数据，首先分
15、杭州西湖区（HZ）、绍兴新昌县（XC）和丽水莲都区（LS）3 个组进行了同一产地样本的品种判别分析试验。8 期 成 浩等：基于化学指纹图谱的绿茶原料品种判别分析24152.2.1 杭州西湖区样本判别结果 根据 SPSS 计算的非标准化判别方程系数，得到判别方程组为：F12.75760.0032GA+0.0014X17+0.0009 X270.0090X36+0.0139X390.0018X400.0290X41F212.7870+0.0065GA+0.0016X170.0163 X27+0.0231X36+0.0105X390.0253X40 0.0796X41式中，GA、X17、X27、X3
16、6X41分别代表不同相对保留时间色谱峰的相对峰面积20。判别函数 F1、F2的特征值分别为 25.2732 和12.5539，典型相关系数分别为 0.9808 和 0.9624，对判别结果的方差分析表明，类间差异明显（P0.0001），即判别结果有效。对训练集各样本的回判成功率为 100%，交叉验证的正确率同样是100%，5 个外部验证样本的正确判别率也是 100%。各样本判别函数得分值作图（图 1），从图 1 也可以看出，判别分类的效果很好。LJ：龙井 43 样本；QT：群体种样本；YS：迎霜样本；（V）：验证 样本。下同 LJ: Longjing 43 sample; QT: Jat sample; YS: Yingshuang sample; V: Validating s
