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1、第二属益生菌与健康及应用技术交流研讨会多子L 淀粉一在乳酸菌微胶囊制剂上的开发 与利用王学佩刘侠王金玲 河北沧州兴济华雨药业公司0 6 1 0 2 2以乳酸杆菌属( L a e t o b a c i l l a s ) 和双歧杆菌属( B i f i d a c l e r i a m ) 为代表的乳酸菌生理作用明 确，安全，是微生态活苗制剂的重要菌源。但因其兼性或专性厌氧、不形成芽孢，而抗逆能力差。 本研究根据已有材料，确定适合于乳酸菌微胶囊化的多孔淀粉生产工艺和微胶囊生产工艺。a 一淀 粉酶和糖化酶比为8 ：1 ，最挞温度5 5 ，时间2 8 h ，P h 5 6 多孔淀粉：成膜材料：菌
2、液为2 7 ；3 ：7 0 ，喷雾干燥进风与出口温度为1 1 2 、5 2 关键j 司：乳酸菌、多孔淀粉、复合酶解、微胶囊1 = 艺多孔淀粉义称微孔淀粉( M i c r o p r o u ss t a r c h ) 是指具有生淀粉酶活力的酶在低于淀粉糊化温度 下作片I 于生淀粉颗粒后形成的一种蜂窝状多孔变性淀粉。其小孔直径为1um 左右，小孔布满整个淀 粉颗粒表面，由表及里向中心深入，孔的容积占颗粒体积的5 0 左右。而以乳酸杆菌属和般歧杆菌 属为目的菌的乳酸菌直径一般不大于lpm ，进入多孔淀粉的孔中，淀粉孔成为一个纳器，以钻入乳 酸卣的多孔淀粉为心材，外面再封孔和包膜成为结构特殊的微
3、胶囊。这种微胶囊具有缓释、抗逆能 力，但一般酶解得剑的多孔淀粉因颗粒结构受剑一定程度的破坏，结构疏松，其冻融稳定性、温度 稳定性、抗剪切能力、颗粒坚同性、粘度稳定性等均低于原淀粉，而活菌微脞囊制荆所需心材重点 解决孔径1 m ，孔的容积丈，整个微胶囊- 呸州，不易碎。而多孔淀粉孔的形成取决于淀粉及淀粉 酶的来源，品种及酶解条件，控制淀粉水解程度，即调节孔数、孔径、孔深、颗粒坚嗣性及结构稳 定性。根据活菌制剂所需，我们生玉米淀粉为原料，确定组合酶解条件对多孔淀粉形成的影响参数， 包括酶底比，缓冲液的p H 值，酶解时间、温度等，确定最佳J = 艺条件，通过化学交联经增强其结构 稳定性，选择交联剂
4、利1 ：艺条件，在形成微胶囊的过程中选择喷雾干燥方法。对乳酸苗以多孔淀粉 为心材微胶囊r 艺进行探讨。 普通玉米淀粉属于谷类淀粉，淀粉颗粒大小中等，直径5 2 6 u m ，形状为圆形和多角形1 k g 玉 米淀粉含13x1 0 ”颗粒，由丁- 直链淀粉含鼙相对较高达2 8 ，含脂类化合物多，易形成直链粉一脂类化合物，颗粒紧密。 生淀粉酶属于淀粉酶的特殊种类，但至今还没有一个严格定义。一般来说生淀粉酶是指可以直 接作 j 朱经蒸煮的淀粉颗粒的酶，生淀粉酶所涉及的酶有好儿种，如。一淀粉酶能激活、加速糖化 酶和活力。T o m m o s h i s aT A K A Y A 等认为，粗酶的活性人
5、丁结品酶( 纯酶) 的活性，内含U 一淀粉酶 的糖化酶的活性人于不含a 一淀粉鲜的纯糖化酶，具有生淀粉酶活力的各种酶之间有协同作刚，单 一纯酶的水解活力并不理想，需要有协同效麻的酶共同作H j ，才能达剑较高的水解能力。 冈此，综合参考资料，能形成多孔淀粉，并有鹰H j 满力的生淀粉酶主要是糖化酶、a 一淀粉酶。 从生产效能上看，选择两咱以上复合酶胁同使H j 是我们选择酶系的目标。 生淀粉a 一淀粉酶( 1 ，4 一a D _ 葡聚糖水解酶，a a m y l a s e 。E c 3 2 1 1 ) 是内切犁淀粉酶， 它作H j 丁淀粉时从淀粉分子的内部任意切开a l ，4 键，使淀粉分子
6、迅速降解，失去粘性和碘的毕 色反廊同时使水解的还原力增加。 生淀粉糖化酶( 生淀粉葡萄淀粉酶，1 ，4 一a D - 葡聚糖水解酶，a 一1 ，4 - G l u e a n 9 1 u c o h y d r o l a s e ，E C 3 2 1 3 ) 是外切刑淀粉酶，由2 种同功酶组成，葡萄粮淀粉酶1 分子时6 6 ， 0 0 0 D a 而酶I I 与酶1 有相同的氨基酸顺序，只是在羧基末端少一段该酶能从淀粉或糖无的1 | 还 原末端开始，以葡萄糖为单位进行水解，虽然葡萄糖淀粉酶能优先水解a 一1 ，4 葡糖苻键，但对a 一1 ， 3 一葡糖苻键和a 一1 6 - 葡糖茴键也有一定
7、活性，只是水解速度很慢，仅及水解a 一1 ，4 - 葡糖苛键活性的6 6 和3 6 。1 、材料与方法1 1 实验材料第二届益生菌与健康及应用技术交流研讨会生玉米淀粉、黑曲霉糖化酶、芽孢杆菌n 一淀粉酶、金龙鱼大豆色拉油、柠檬酸( 分析纯) 、磷 酸氢二钠( 分析纯) 、氢氧化钠( 分析纯) 、甲苯( 分析纯) 、乙醇( 色谱纯) 、嗜酸乳杆菌、双歧杆 菌、培养乳酸菌用M R S 培养基( 酪蛋向胨：l O g 、牛肉高：l O g 、酵母高：5 9 、无水乙酸钠：5g 、柠 檬酸三胺：3g 、磷酸氢二钾：2g 、硫酸镁：0 5 6g 、硫酸锰：0 2 8g 、葡萄糖：2 0g 、吐温一帅：1
8、g 、琼脂：1 5g 、蒸馏水1 0 0 0 m L ，p H 6 2 _ 6 4 ) 、其它为常规试剂分析纯1 2 、实验设备 超净工作台、磁力搅拌器、阿贝折光仪、F A l 0 0 4 上皿电子天平、S H BI I I 循环水式多用真空泵、 旋转蒸发器、乳酸菌发酵与检测设备( 分析天平，感量为0 0 0 0 1 、平皿：直径为9 c m 、试管：1 8 1 8 0 咖、 吸管：容量为I m L 、三角烧瓶；容量为2 5 0 r a L 、玻璃珠：直径为5 m m 、洒精灯、试管架、橡皮胶头及 其它) 、W 5 0 1 升降恒温水浴锚、振荡器、D R Z - 4 型电阻炉温度控制器、7 2
9、 2 光栅分光光度计、P H G - 9 1 0 1 3 S A 型电热恒温鼓风干燥箱、L X J I I 离心沉淀机。L P - 5 0 0 型离心式喷雾干燥塔、其它 1 2 实验方法1 + 2 I 生淀粉酶活力测定 2 5 _ 1 6 ( w v ) 生玉米淀粉悬液2 O m L 加入到5 0 r a l 三角瓶，加口H 3 5 的0 2 o l LN a 挪P O , - O 1 m o l L 柠檬酸缓冲液2 O r a L ，4 0 “ C 预热l O m i n ，加入1 O m L 适当稀释的酶液，在4 0 恒温下振荡反应3 0 m i n 后，加4 的N a 伽溶液0 5 m
10、L 终止反应。反应液用3 0 0 0 r m i n 离心2 0 r a i n ，上层清液崩D N S 法测还原糖。 酶活定义：在以上分析条件下，1 h 释放I m g 葡萄稽的酶量为一个洛力单位。 I 2 2 多孔淀粉产物得率测定称取表面培养皿重量( 精确至0 ，0 0 1 9 ) ，加入水解得到的湿多孔淀粉，在6 0 下常压干燥， 称取总重罐，两者的重量差即为反应后多孔淀粉的重量，再除以反应前淀粉的重量，即可得到多孔 淀粉产物得率。 I 2 3 多孔淀粉吸油率测定 称取多孔淀粉B 克( 精确0 0 0 0 1 9 ) ，恒温下与5 m L 大豆色拉油混合搅拌3 0 r a i n ，置于
11、已知重 量C 克( 精确0 0 0 1 9 ) 的砂芯漏斗抽滤，直至没有液滴滴F 。根据砂芯坩埚重量D 克( 精确0 0 0 0 1 9 ) ， 计算吸油率肼。o _ B c l 占1 ，2 4 酶作J I 的协同效府 分别经糖化酶、a 一淀粉酶和复台酶作片j 淀粉颗粒，每隔4 h 取样，测定各自在不同反应时间的 吸油率，比较淀粉颗粒在不同酶作闱F 的成孔情况，验证坝酶复合作_ l j 。1 2 5 多孔淀粉酶解l ：艺 2 0 9 生淀粉加入到2 5 0 m L 三角瓶中，加p f f 46 的0 2 m o l LN a ：H P 0 4 0 1 m o l L 柠檬酸缓冲液4 0 m L
12、 ， 滴入l 滴甲苯，加入适当稀释的酶液，在4 0 “ C 恒温F 振荡反应2 4 h 后，离心( 3 0 0 0 r m i n ，2 0 r a i n ) ， 分离上清液，沉淀在6 0 “ ( 2F 常压干燥，粉碎即可。 1 2 6 州形物 川阿贝折光仪在2 0 “ C 卜恒温测定。1 2 7D E 值( 还原糖测定) 称取样品2 0 0 0 0 9 加入水溶解，以斐林法测定还原糖的鼙2 5 0 肋 胙X1 0 0 0膏P 西脱 R p 一一l m L 斐林溶液相当丁葡萄糖的质肇( m g ) ；M 一一样品质颦( g ) ： V 一一一滴定消耗样液的体积( m L ) ； D W C
13、一一一试样中州形物的自分含量。 1 2 8 乳酸苗活苗数的测定1 2 8 1 采样第二届益生菌与健康及应用技术交流研讨会采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具。采样 后应尽快检验，否则将样品放在低温干燥处。1 2 8 2 试样稀释及培养 1 ) 精确称取产品l g ( 精确至0 0 0 0 2 9 ) ，转入内装9 9 m L 无菌生量盐水和几颗玻璃珠的三角瓶中， 摇动三角瓶( 2 0 0 r m i n ，3 0 4 0 r a i n ) ，使样品充分溶解备用，经充分振荡制成1 ：1 0 0 的均匀稀释液。 2 ) 吸取上述的待检液1 m L 。加入装
14、有9 m L 无菌生理盐水的试管中，( 注意吸管尖端不要触及管 内稀释液) 振荡摇匀，作成l ：1 0 0 0 稀释液。 3 ) 按2 操作，至样品溶液稀释到1 1 08 备用。每一次操作必须用无菌吸管，吸管不可重复使用。 4 ) 选择2 - 3 个适宜稀释度，吸取l m L 稀释液于平皿内，每个稀释度做两个平皿。 5 ) 稀释液移入平皿后，应及时将凉至4 6 4 - 1 的M R S 培养基注入平皿1 5 m L ，小心转动平皿使试 样与培养基充分混匀，从稀释试样到倾注培养基之间，时间不能超过1 5 m i n 6 ) 待琼脂凝固后倒置平皿于3 0 4 - 1 恒温培养箱内培养，7 2 3
15、小时后取出，计数平板内菌落数 目，菌落数乘以稀释液倍数，即得每克样品中所含乳酸荫的活菌总数。 1 2 8 3 、苗落计数方法：做平板菌落计数时，可片j 肉眼观察，必要时借助放大镜检查，以防遗 漏。在计数出各平板菌数后，求出同一稀释度两个平板的平均数。1 2 8 4 、菌落计数的报告 以3 个重复的I 基落数相差不悬殊，每个平皿菌落数在3 0 3 0 0 之问来确定此操作的准确性，否则 需要重新操作。最终菌落数总数取3 个平皿中的菌落总数的平均数。以上操作均为无菌操作。1 2 8 5 、稀释度的选择 1 ) 席选择平均菌落数在3 0 - 3 0 0 之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。 2 ) 如
16、有两个稀释度，其生长的菌落数在3 0 一3 0 0 之间，视两者2 比如何来确定，如其比值小于2 ，应报告其平均数；如大于2 ，虬0 报告其中较小的数字。 3 ) 如所有稀释度平均菌落数均大于3 0 0 ，则戍按照稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 4 ) 如所有稀释平均菌落数均小于3 0 ，则应按照稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 5 ) 如所有稀释度均无菌落生欧，则以小于1 乘以晟低稀释倍数报告之。 6 ) 如所有稀释度平均菌落数均不在3 0 - 3 0 0 之间其中一部分犬y - 3 0 0 或小于3 0 时，则以晟接近 3 0 0 或3 0 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。1 2 8 6 、结果报告 菌落数在1 0 0 以内时，按其实有数报告，大于1 0 0 时，采用两位有效数字，在两位有效数字后 面的数值，以四舍五入方
