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1、杂褰弼煎衡纽织莲画骧化蛔庖翮研宽吕英海( 山东科技大学化工学院，青岛2 6 6 5 1 0 )摘要：皋试验研究杂交稻愈伤组织在农杆茵夼导法基因转化过程中的应用情况。通过比较基因转化中的愈掳组织的请导率与转化率，得出了选用适宜的水稻基因型，并采用分裂旺盛、状态最好的外植体作为侵染材料是提高转化频率的关键。适宜的温度、茵班度对提高转化效率也具有重要影响；同时还探讨了吐温( T w e e n ) 一2 0 ，培养基中举加成分、干燥处理等因素婶转化中的愈伤组织的影响。关蕾词：杂更糟；惫估组织；劝胚 温度 衷度 添加成分我国杂交水稻年种植面积超过0 1 3 亿h m 2 ，占水稻种植面积的5 0 5
2、5 ，可以说杂交稻在我国粮食作物中占有举足轻重的地位。但是当前杂交稻米质普遍较差，现有的稻米品质已不能满足人们的需求，而通过传统的杂交技术改良杂交稻所需周期长，改良单基因控制的性状难度较大。因此转基因技术就越来越成为杂交稻品质改良的主要方法，其中根癌农杆菌介导法是常用到的转基因方法。利用根癌农杆菌转化植物细胞的前提是植物细胞应处于旺盛的分化期，因此常用组织培养过程中得到的分裂旺盛的胚性愈伤组织作为试验材料，未成熟胚经常用来作为诱导愈伤组织的材料。本试验对比了不同的幼胚在农杆菌介导法基因转化中的愈伤组织诱导与转化情况，为进一步探讨优良转基因条件奠定了基础。1 材料与方法1 1 供试水稻品种杂交稻
3、三系中的恢复系湘晴和不育系香粳。 1 2 菌株菌株：根癌农杆菌( A g r o b a c t e -r i u mt u m e f a c i e n t s ) ：E H A l 0 5 ，携带改造过的p C A M B I A l 3 0 0 质粒，含有潮霉素抗性基因。 1 3 培养基用于本研究的细菌培养基为 Y E B 、A B 、A A 和A A M ，水稻组织培养培养基为N 6 、M S 等。 l - 4 试验方法开花后1 5 天的未成熟种子( 带壳) 经7 0 乙醇浸泡0 5m i n 1r a i n 后，倒去乙醇，用无菌水冲洗1 次，然后放置于含2 有效氯的 N a C
4、l O 溶液中( 加2 滴3 滴吐温一2 0 ) 消毒6 0m i n 9 0m i n ，无菌水冲洗9 次1 0 次。在无菌条件下，用解剖刀将胚挤出，挑取幼胚接种于N 6 D 2 培养基上，于2 6 暗培养诱导愈伤组织，4 天后取2m m 直径大小的幼胚愈伤组织直接进行农杆菌感染。感染过程中将幼胚的愈伤组织浸泡于用A A M ( 培养基) 重悬的1 0m l ，添加吐温一2 0 ( 3 滴5滴l o om 1 ) 的菌液( O D 一0 8 ) 中，静置1 0r a i n ，将愈伤挑出，用无菌纸吸干，转移到准备好的、垫一层无 菌滤纸的N 6 D 2 C 转化培养基( 舍有乙酰丁香酮，缩写为
5、A S ) 上。并在N 6 D 2 C 培养基的无菌滤纸上滴几滴A A M ( A s = 1 0 0 - M ) 培养基。共培养3 天后，切去胚根并用无菌重蒸水洗1 遍、头孢霉素洗3遍后放至吸水纸上吸干，然后转人筛选培养基N 6 D 2 S I 进行筛选，3周后挑选生长旺盛的浅黄色的愈伤组织转到N 6 D 2 S 2 筛选培养基上筛选培养，3 周后再选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基M S R C H 上预分化( 暗培养) ，1 0 天 后再转移到分化培养基M S R C H上光照培养( 光照1 2h 天) ，约1 0天后在抗性愈伤上长出绿色芽点，转到分化培养基上等苗长成后进行炼苗
6、、移栽。2 绪果2 1 幼胚的愈伤组织的诱导和抗性筛选幼胚放在含有相同激素浓度的N 6 培养基上，在相同的培养温度下培养，不同时期的幼胚愈伤组织诱导率有很大差异，生长旺盛的湘晴( 1 ) 幼胚愈伤组织诱导率8 8 0 ，达到了较高的诱导率。本试验部分老化的湘晴( 2 ) 产生的大部分愈伤组织块小而且易褐化，生长缓慢，愈伤组织诱导率为6 2 9 。在筛选过程中，随着抗生素浓度梯度的增加，愈伤组织褐化明显，其中少数愈2 8 4以人为本和谐发展青岛市第四届学术年会论文集伤组织块，会较快地在边缘长出乳白或者鲜黄色的、致密的抗性愈伤组织，大部分愈伤组织在共培养后的筛选培养基上死亡较快。最后得到的抗性愈伤
7、组织比例( 愈伤转化频率) 差异更加明显，湘晴( 1 ) 得到抗性愈伤组织比例达到5 2 9 ，愈伤组织分化率为1 6 ，4 ；而湘晴( 2 ) 抗性愈伤组织比例仅有9 1 ，愈伤组织分化率为8 7 ；差异很大。湘晴( 1 ) 和湘暗( 2 ) 比较可见同种材料不同时期的幼胚愈伤组织诱导率和分化率有很大差异，香粳不育系得到比例分别为1 4 2 和7 5 。力下进行。2 3 不同温度对湘晴转化效率的影响本研究以湘晴( 1 ) 为材料设计了三个温度( 1 9 、2 3 、2 7 C ) 。对湘晴愈伤组织的分化率进行了分析( 表2 ) ，从中可知1 9 的愈伤组织分化效率为7 5 ，2 3 的分化效
8、率达到9 3 ，2 7 分化频率降低到6 7 。从中可初步断定在1 92 3 ，随着培养温度的提高，水稻转化效率也相应提高 而在2 3c 2 7 之间，随着培养温度的提高，水稻转化的效率反而有降低趋势。而且在2 7 条件下，三天培表1 三系杂交稻转化数据统计湘晴( 1 ) 为1 2 天2 0 天的幼胚；湘晴( 2 ) 为2 0 天以后的幼胚；香粳指的是香粳不育系2 2 愈伤组织的分化与植株的再生愈伤组织从筛选培养基上转入预分化培养基上暗培养1 0 天，愈伤组织表面变的干燥，部分愈伤组织块不再致密，很容易变成碎末状，极少数愈伤组织变成很多细小的黄色的愈伤组织颗粒，蓬松地分布在培养基上。1 0 天
9、后把愈伤组织从预分化培养基转移至分化培养基上，愈伤组织在6 - B A 、K T 等激素的作用下，表面很快出现大量绿点，但是香粳不育系的绿点较少，而且有些绿点后来又褪去绿色，不能再分化出芽，极少数的愈伤组织长出根毛，也不能分化出芽。大部分绿点长出绿芽，绿芽长成小植株转到含有N A A 的生根培养基上，整个过程都是在潮霉素5 0m g L 的选择压养以后，会出现肉眼可见的农杆菌菌落，也许正是出于无法抑制农杆菌过度生长而造成了水稻转化效率降低。表2 不同温度对转化效率的骺响温度愈伤组织分化出苗的愈伤组织 c数块愈伤组织块分化率“1 96 72 35 42 71 0 53 讨论3 1 转化材料和基因
10、型对愈伤组织诱导和基因转化的影响使用幼胚作为转化材料可以取得很好的效果，这其中的原因可以概括为以下两点：第一，未成熟胚细胞生长分裂旺盛，有利于转化的实现；第二，较短时间的组织培养，减少了组织培养中体细胞变异的可能性。但是幼胚所处的生理状态对愈伤组织诱导率也有很大影响。应该说，1 2 天2 0 天( 胚囊为二核到四核时期) 的未成熟胚转化率相对较高，2 0 天后的未成熟胚种子变硬少浆，胚不易挤出，转化率迅速下降。不同水稻品种在愈伤组织诱导和分化能力上的差异，可能是由于基因型等多种因素综合作用的结果。因此，选用适宜的水稻基因型，并采用分裂旺盛、状态良好的外植体作为侵染材料是提高转化频率的关键。3
11、2 不同温度对湘晴转化效率的影响愈伤组织的诱导常常在传统的温度范围内( 2 5 2 8 ) 进行，但凡尔特曼( F e l d m a n n 1 3 ) 则认为随着温度的升高，转化效率会降低。蒂伦( D i l l e n ) 等0 1 也认为农杆菌具有最强侵染力的生长温度并不是农杆菌最适生长温度，而是在较缓慢生长温度条件下。这可能意味着当农杆菌处于较高温度，快速生长时，侵染有关的基因表达受阻，导致侵染力下降。尽管低温能使质粒稳定，不易丢失，也能够控制细菌的大量生长。但低温也会导致植物细胞的生长受抑制。所以适宜的温度有助于杂交稻转化效率的提高。3 3 根癌农杆菌茵液浓度的选择菌液浓度对转化效
12、率肯定会有影响，合适的浓度是有利于转化的成功。菌液的浓度太低，造成农杆菌的数目少，降低转化效率；菌液浓度过高，由于营养不良会显著增加死菌数目，使有效菌数目减少，而且菌体本身容易发生凝集而影响附着。海埃( H i e i ) 等“3 、刘志学等E “、项友斌等“。对菌液的适宜浓度进行了研究，适宜的菌液浓度在O D 。一1 0 左右。杂交稻愈伤组织基因转化的应用研究吕英海* 2 8 53 4T w e e n - 2 0 对愈伤组织和转化效率的影响由于T w e e n 一2 0 分子中有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基，可作某些药物的增溶剂。在幼胚接种的除菌阶段，在2 N a c l O 溶液中添加
13、几滴T w e e n 一2 0 ，会增强2 N a c 1 0 的除菌效果，观察到幼胚的污染率降低明显。在农杆菌与愈伤组织震荡培养阶段，T w e e n - 2 0 可能会加强农杆菌在愈伤组织表面的附着，提高转化效率o 。T w e e n 一2 0 还会造成愈伤组织褐化速度减慢，褐化时间延迟，在湘晴中这种变化就非常明显。3 5 培养基中添加的几种成分对愈伤组织的影响愈伤组织的诱导多采用M S 或N 6 培养基，后者适于粳稻的愈伤组织诱导。培养基中的蔗糖在组织培养中不仅为培养物提供能量，而且 是培养物渗透环境的主要调节者口 。酵母抽提物( 5g L ) 是一种极好的氮源，它对愈伤组织的良好
14、生长是必要的，可以完全消除亚硝酸作用，常用水解酪蛋白( 3g L ) 代替酵母抽提物。2 4 一D ，N A A ( 萘乙酸) ，K T ( 激动素) 的合理配合使用比使用单一激素效果好。山梨醇作为渗透压调节剂，在水稻组织培养中具有重要的作用。预分化培养基( 含山梨醇1 0g L ) 中渗透压的提高，会适当降低愈伤组织的含水量，有利于乳白或鲜黄色的抗性愈伤组织分化和绿苗的再生。 3 6 愈伤组织的干燥处理对转化频率的影响干燥饥饿处理可提高植株再生频率，主要表现在在琼脂含量稍高或者添加山梨醇的培养基中，会使愈伤组织有利于分化。已经变绿但不出苗的愈伤组织置于滤纸上，暗处干燥1 天后，再转入新鲜的培
15、养基有利于绿苗分化。干燥处理的时间更长一点，还可以将农杆菌杀死。其原因可能在于干燥处理影响矿质元素的吸收和脯氨酸的含量。总之，愈伤组织的生长与基因转化受多种因素的影响，但是选用适宜的水稻基因型并采用分裂旺盛、状态良好的外植体作为侵染材料是提高转化频率非常关键的一步。适宜的温度、菌浓度对提高转化效率也具有重要影响；另外我们还需要进一步探讨T w e e n 一2 0 、培养基中添加成分干燥处理等因素对转化中的愈伤组织作用机理。这些为进一步优化杂交稻的转化体系提供了参考依据，同时为其他农作物的改良也有一定启迪。参考文献： 1 F e l d m a n nK AT - D N Ai n s e r
16、 t i o nm u t B g e n e s i si nA r a b i d o p s l s ；m u t a t i o n a ls p e ct r u m E J ，P l a n tJ 1 9 9 1 ，1 ：7 18 2 。 2 D d l e nW ，D eC h e r c qJ K a p i l aJ T h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo nA g r o b a c t e r i u mt u m e f a e e n sm e d i a t e dg e n et r a n s f e rt op l a n t s J ，P l a n tJ ，1 9 9 7 ，1 2E1 4 5 9 - -14 6 3 3 H i e iY ，O h t aS ，K o m a
