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1、环境污染与防治 网络版 第 4 期 2009 年 4 月1环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因检测研究进展环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因检测研究进展李大辉 刘慧君# （北京北九环境技术实验室，北京 102209）摘要摘要 环境内分泌干扰物（EEDs）会对人类健康及环境造成有害的影响。它与许多生殖相关疾 病、发育障碍及某些癌症发病率的升高密切相关，已成为全球关注的热点问题。激素受体介导的报告 基因试验是一种快速、灵敏筛选和甄别环境化学物质内分泌干扰活性的方法，在内分泌干扰物的检测 中广泛应用。在总结国内外相关研究的基础上，对当前激素受体介导的报告基因试验系统的研究进展 情况进行了综述。 关键词
2、关键词 环境内分泌干扰物 雄激素受体 雌激素受体 报告基因Research progress on receptor reporter gene assays for environmental endocrine disruptors Li Dahui, Liu Huijun. (Beijing Beijiu Laboratory of Environmental Technology, Beijing 102209, China) Abstract：Environmental endocrine disruptors (EEDs) are sort of chemicals with pa
3、ssive effect on the health of human and protection of environment. EEDs are closely related to reproductive, developmental and cancer-related diseases. The study on hazards of EEDs has become a hot topic on a global wide scale. The receptor reporter gene assay is a rapid and sensitive method for scr
4、eening the potential EEDs from multitudinous chemicals presented in the environment. As an in vitro assay prior to in vivo one, the method has been widely applied to assessing the risk of EEDs on health. To take advantage of the receptor reporter gene assay in application, the research progress on t
5、he assay system including mechanisms of effects and tests, types of host cells, receptors and reporter genes, are reviewed. Keywords：environmental endocrine disruptors; androgen receptor; estrogen receptor reporter gene 随着工农业生产的发展和科学技术的进步，人类合成了越来越多的化学物质。环境作为化学品的最终排放点，污染现象越来越严重，超过了环境的自净能力，造成环境污染。环境中存
6、在的许多外源化学品能够干扰人和动物体内激素的合成、释放、运输和代谢等一系列生理过程，扰乱内分泌系统的正常功能，这样一类化学物质统称为环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors，EEDs）1。内分泌干扰物的种类繁多，包括天然的和人工合成的化学物品，例如，工业化学物（树脂原料、重金属、绝缘材料、清洁剂等） 、农药（杀虫剂、除草剂、杀真菌剂等） 、植物和真菌性激素（异黄酮类、拟雌内醇等） 、药用激素等2。实验室研究以及流行病学调查结果表明：环境内分泌干扰物会危害个体及其子代的健康，如导致内分泌紊乱、生殖能力下降、生长发育异常、出生缺陷和肿瘤发生率增加等3-
7、6。1 环境内分泌干扰物的重要特征环境内分泌干扰物的重要特征（1）亲脂性。环境内分泌干扰物具有很强的亲脂憎水性，不溶或者微溶于水，而易分配于脂肪中。由于动物及人体中都含有相当数量的脂肪组织，当这些化合物通过各种途径为生物体所摄入后，就会在脂肪组织中累积形成“生物蓄积” ，其浓度一般远高于周围环境介质中的化合物浓度，形成所谓的“生物浓缩”1。第一作者：李大辉，男，1971 年生，博士，研究方向为环境生态。# 通讯作者。环境污染与防治 网络版 第 4 期 2009 年 4 月2（2）环境持久性。环境内分泌干扰物结构稳定，对光、热、微生物、生物代谢酶等各种作用都具有很强的抵抗能力，因而在自然条件下很
8、难发生降解。一旦进入环境中，它们会在水体、土壤和底泥等环境介质以及生物体中长期残留，时间可长达数年甚至数十年。同时，能够通过食物链的生物富集和放大作用，在人体中蓄积，还可能通过哺乳途径直接危害婴幼儿的健康1,7。（3）结构多样性。环境内分泌干扰物种类繁多、结构迥异。它们虽具有激素功能，但与生物体内天然激素雌素酮或其他类固醇激素在化学结构上迥然不同，例如，雄激素中的睾丸酮和雌激素中的雌素酮都是四环结构，而 DDT、DES（己烯雌酚）是两环结构，烷基酚是单环结构7。2 环境雌激素和雄激素干扰物的潜在健康危害性环境雌激素和雄激素干扰物的潜在健康危害性目前已确认或可疑的环境内分泌干扰物大多数是雌激素或
9、雄激素的干扰物，它们对人类和动物的生物学效应主要表现为致癌作用、对生殖与发育、神经系统和免疫系统的毒效应等方面1。研究表明2-6，人类精子的数量呈下降趋势可能与 EEDs 的暴露有关；男性睾丸癌、女性乳腺癌等发病率不断升高可能也是 EEDs 暴露的结果；EEDs 可引起鸟和鱼类性别比例改变，导致鸟、鱼、贝类和哺乳动物生育率下降，如果这种效应长期存在，必然导致某些物种的灭绝。环境内分泌干扰物可以直接作用于内分泌系统，影响激素的释放及其在靶器官的效应，再通过反馈作用影响到神经系统，或者直接作用于神经系统，引起行为、精神等的改变。大鼠、小鼠试验证明体内性激素水平的升高可促进自身免疫性疾病的发生，而通
10、过动物实验和对野生生物的调查也证实，环境雌激素能使动物胸腺重量减少、T 细胞介导的免疫功能下降。多氯联苯、二恶英、已烯雌酚、有机氯农药等可以影响机体的免疫功能，表现为免疫抑制或过度反应7。研究还表明，一些EEDs 的作用呈现出非单一的“剂量-效应”生物学效应，也就是 EEDs 在低剂量暴露时比高剂量产生更大的不良效应（即低剂量效应） 。这种现象首先在胎鼠暴露于不同剂量的雌二醇、己烯雌酚和双酚 A 时，前列腺内分泌功能改变的研究中发现。暴露于环境浓度水平双酚 A 的胎鼠在成年后出现前列腺重量增加，精子数减少，雌鼠表现为性早熟，而且较其他高剂量组症状明显8。3 环境内分泌干扰物的筛选与评价方法环境
11、内分泌干扰物的筛选与评价方法环境内分泌干扰物对健康的危害和生态环境的威胁已经引起诸多有关国际组织甚至政府部门的高度关注，成为目前在生态学、内分泌学、毒理学等多个领域的研究热点之一7。自 1995 年以来，美国、日本、英国、丹麦等多国政府相继成立内分泌干扰物研究机构，并且投入巨资启动了环境内分泌干扰物对人体健康效应的研究项目，其中首先需要解决的关键问题之一是科学地检测、评价内分泌干扰物。当前国际上通常采用第一阶段筛选（Screening） 、第二阶段测试（Testing）的多阶段测评程序对种类繁多、作用复杂的内分泌干扰物效应进行评估8。作为第一阶段初筛方环境污染与防治 网络版 第 4 期 200
12、9 年 4 月3法的系统必须能够灵敏、快速、经济地筛选大量的环境化学物。针对内分泌干扰物的筛选和评价主要包括体内法和体外法两类。体内法是在不破坏生物体条件下对化学物质的内分泌干扰作用进行测定，通过相应的终点指标进行评价，包括体内的子宫增重试验9、啮齿动物青春期筛选试验10等方法。体内方法具有相对的准确性和权威性，但是操作过程复杂、费时费力，不适用于高通量测试和现场应用，特别在环境低浓度暴露的情况下，常不易获得正确的结果。体外法主要有激素依赖细胞增殖试验11、激素受体结合试验12以及激素受体介导的报告基因试验13,14等方法。其中的激素受体介导的报告基因试验检测方法以快速、简易、经济、可靠的特性
13、而成为体外筛选方法的研究和发展的主要方向。本文将主要论述激素受体介导的报告基因试验系统的研究进展情况。4 环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因试验环境内分泌干扰物筛选的受体报告基因试验4.1 激素受体介导的报告基因试验的基本原理环境内分泌干扰物大多数是雌激素和雄激素干扰物。它们的作用机制十分复杂，主要是通过与激素受体结合途径，影响内源性激素的正常功能，产生内分泌干扰作用7。研究表明，这类内分泌干扰物可以作为配体与类固醇激素受体，例如雌激素（estrogen receptor, ER）或雄激素受体（androgen receptor, AR）结合，从而导致受体蛋白构型的改变、二聚化、与热休克蛋白等
14、分子伴侣解离和磷酸化等一系列变化，这种“活化”后的受体暴露其结构中的 DNA 结合区，并与靶基因启动子区域中作为顺式调控元件的激素反应元件（hormone response element，HRE）发生特异性相互作用，对靶基因的转录表达发挥调节作用，并产生相应的生物学效应15。结构不同的 EEDs 通过与不同的受体结合，表现为（抗）雌激素效应、 （抗）雄激素效应。激素受体介导的报告基因试验就是基于上述作用机制而建立起来的一种高灵敏度的体外筛选方法。它采用基因重组技术构建两种质粒：一种是能够在体外表达有活性的激素受体的表达质粒；另外一种是带有相应的激素反应元件以及由反应元件所调控的报告基因的报告
15、质粒。然后将表达质粒和报告质粒共同转化宿主细胞（酵母或哺乳动物细胞） ，得到重组细胞株，建立相应的受体转录激活系统，最终通过检测外源性化学物质所诱导的报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化，可以间接反映 EEDs 作用下内源性靶基因的表达情况，作为筛选评价化学物内分泌干扰活性强弱的依据。4.2 激素受体介导的报告基因试验的宿主细胞在激素受体介导的报告基因试验中，常用的用于转染的宿主细胞是酵母细胞和哺乳动物细胞两大类。4.2.1 酵母细胞酵母作为一种单细胞真核生物表达系统，由于遗传背景清楚、表达产物具有生物学活性、无内源性激素的干扰，并且灵敏度高、特异性较强、重现性好、操作简便等特点环境污染与防治
16、 网络版 第 4 期 2009 年 4 月4而适合于作为大量环境化学物的高通量初筛方法。AMOLD 等16建立了一种酵母雌激素系统，用于评价狄氏剂、毒杀酚、硫丹和氯丹的拟雌激素活性。通过检测报告基因 LacZ 的表达产物-半乳糖苷酶的活性，评价环境雌激素效应。MILLER 等17应用酵母重组系统对 73 种酚类化合物进行检测，筛选出 32 种具有雌激素活性的物质。解玮等18利用重组酵母细胞系统测定了自来水及水源水有机提取物的类雌激素活性。李湘鸣等19研究了不同浓度的苯甲酸雌二醇、雌二醇和双酚对重组酵母细胞-半乳糖苷酶的活力的影响。重组酵母检测系统用于环境雌激素的筛选灵敏度较高，例如 17-雌二醇（E2）在不同重组酵母系统中产生 50%最大效应的浓度值 EC50在 0.13.0 nmol/L13。但是由于酵母细胞的细胞壁结构与哺乳动物细胞的细胞膜结构有明显不同，可能会造成对外源化学物通透性的
