《人支气管上皮细胞在呼吸道合胞病毒感染后CFTR功能及上皮修复功能研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人支气管上皮细胞在呼吸道合胞病毒感染后CFTR功能及上皮修复功能研究（111页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号U D C博士学位论文密级人支气管上皮细胞在呼吸道合胞病毒感染后C F T R 功能及上皮修复功能研究S t u d yo nt h ef u n c t i o no fC F T Ra n de p i t h e l i u mr e p a i r i n gi nH u m a nB r o n c h i a lu n d e rt h ei n f e c t i o nb yR S V作者姓名： 学科专业：学院( 系、所) ： 指导教师：论文答辩日期竺高戈 生理学 基础医学院( 生理学系) 秦晓群教授似_ 7答辩委员会中南大学 二。一二年十月原创性声明l I I l l
2、lI II l lUl l II l lIIIl Y 2 4 2 5 17 1本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。一名：杰生嗍姓年且月争学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采
3、用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。名：越翩签名婢眺巡年且哗博士学位论文中文摘要摘要目的：呼吸道合胞病毒( R e s p i r a t o r ys y n c y t i a lv i r u s ，R S V ) 感染是临床最常见的，也是儿科最常遇到的呼吸道病原之一。支气管上皮细胞在R S V 感染后，其病理改变取决于某些离子通道的功能活性及表达密度，其是否抑制了其囊性纤维化跨膜转导调节因子( C y s t i cF i b r o s i sT r a n s m e m b
4、r a n ec o n d u c t a n c eR e g u l a t o r ，C F T R ) 的表达水平和功能。我们拟建立R S V 感染离体支气管上皮细胞模型，对R S V 感染支气管上皮细胞后C F T R 的表达及功能进行研究。方法：1 ) 建立R S V 感染离体培养支气管上皮细胞模型将原R S V 病毒悬液( T C I D 5 0 = 1 0 - 3 g ：z O 1m 1 ) 按1 ：1 0 0 0 0 0的浓度稀释，得R S V 病毒感染人支气管上皮细胞模型的初始病毒浓度，以此浓度的R S V 病毒感染人支气管上皮细胞制备离体R S V病毒感染人支气管上皮细
5、胞模型。R T - P C R 法验证模型中R S V 存在以及其转录表达水平。2 ) 人支气管上皮细胞感染R S V 后C F T R 的表达取对数生长期R S V 感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、R S V 感染后传代第1 代的细胞和可稳定传代的模型组细胞，通过免疫荧光的方法检测R S V 稳定感染后细胞C F T R 的蛋白水平定位博士学位论文及表达；W e s t e m b l o t 法检测R S V 稳定感染后细胞C F T R 的蛋白表达；q R T - P C R 法检测R S V 稳定感染后细胞C F T R 的m R N A 表达水平。3 ) 人支气管上皮细胞感
6、染R S V 后C F T R 的功能变化取对数生长期R S V 稳定感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、R S V 感染后传代第l 代细胞和稳定传代的模型组细胞，采用全细胞记录的方法记录R S V 持续感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组和模型组细胞上C F T RC 厂的变化。加入激动剂5g M 的f o r s k o l i n 以后，激活c 舢唧诱导C F T RC 厂电流，细胞被钳制在一4 0m V ，给予不同的电压刺激，电压自1 0 0m V 逐步增至l J + 1 0 0m V ，去极化电压时程为2 0 0m S ，步阶为2 0m V ，间隔为2S 。去极化电压结束后恢复至
7、4 0m V 钳制电压。取各个电压状态下最大电流值，绘制I 州关系曲线。用M Q A E 荧光染料法检测3 组细胞的细胞内C 1 - 浓度，制备标准品，检测标准品C l 一浓度，绘制C l - 、浓度标准曲线，根据C 厂浓度标准曲线，计算出待测3 组支气管上皮细胞中C 厂浓度，同时M Q A E 荧光染料法检测3 组细胞的细胞内C 1 - 浓度荧光强度变化率。4 ) 人支气管上皮细胞感染R S V 后上皮修复功能改变制备R S V 感染人支气管上皮细胞的损伤模型后，用显微视频分析B I 2 0 0 0 图像免疫组化分析系统分别于机械损伤后0h r s ，8h r s ，1 2h r s ，1
8、8h r s ，2 4h r s 测量缺损面积一次，收集所有时间点的缺损区域图像，勾画缺损区域的边缘，以相关系数r 来衡量两者是否存在直博士学位论文中文摘要线相关关系，绘制时间与修复面积的直线回归方程：Y = a + b X ，计算损伤修复指数( R I ，r e p a i ri n d e x ) ，R I 值等于回归方程中b 的绝对值( R I =lbI ) ，以此反映不同处理组之间不同的修复速度，直线的斜率为损伤修复指数，斜率越大，损伤修复速度越快。结果：1 ) R S V 感染离体培养支气管上皮细胞模型的建立R T - P C R 法验证模型中R S V 存在以及其转录表达水平，发现
9、在R S V 感染后的R S V 感染人支气管呼吸道细胞模型中，最初几代的R S V 的表达水平是逐步增高的，然后维持在较稳定水平，但是从细胞的形态学上来观察，并没有引起肉眼可见的细胞病变，同时也未被人支气管上皮细胞所清除。表示R S V 稳定感染离体培养支气管上皮细胞模型建立成功。2 ) 人支气管上皮细胞感染R S V 后C F T R 的表达的改变取对数生长期R S V 稳定感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、R S V 稳定感染后传代第1 代细胞和稳定传代的模型组细胞，通过免疫荧光的方法检测R S V 感染细胞C F T R 的蛋白水平定位及表达，并随机选取视野，计数荧光染色阳性细
10、胞的百分率。结果显示在R S V 感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组细胞的细胞膜及胞浆中可见较多的绿色染色的C F T R ，并且荧光染色阳性细胞的百分率较高；在R S V 稳定感染模型传代第1 代细胞就发现其细胞的细胞膜及中文摘要胞浆中C F T R 明显减少，并且荧光染色呈阳性细胞的百分率明显减少；而在R S V 稳定感染模型组细胞中细胞膜及胞浆中C F T R 表达较阴性对照组细胞明显减少，较R S V 感染模型第1 代细胞也有略有减少，并且荧光染色阳性细胞的百分率也略有减少。推测R S V 感染细胞后，可破坏气道上皮结构的完整性，致使局部气道微环境呈失稳态的状态，使得气道功能失调，改变
11、了气道上皮应激应答机制，导致气道的功能和结构重塑，形成慢性气道炎症和气道病理改变。分别提取R S V 感染人支气管上皮细胞模型阴性对照组细胞、R S V 感染后传代第l 代细胞和稳定的R S V 感染模型组细胞的膜蛋白，W e s t e r n b l o t 法检测R S V 感染后细胞C F T R 的蛋白表达，胶片曝光结果使用Q u a n t i t ) ，O n O 灰度扫描软件处理数据，其表达强度用C F T R 灰度值B a c t i n 灰度值表示，重复3 次，统计结果，绘制直方图。实验结果显示，相对于阴性对照组细胞，R S V 感染后第1 代细胞和稳定R S V 持续感染
12、的模型组细胞C F T R 表达明显降低，结果具有明显差异，宰P 畦墨辐损伤：J 喇修复结果( 。 型 组损伤1 二，J 制謦夏结果( j ：塥伤。廿t 修娶吉卓- 一一捅南二一l 埘垮曼名果f 。：-图4 8R S V 持续感染人支气管上皮细胞模型组细胞损伤修复的镜下结果4 3 3 3R S V 感染人支气管上皮细胞模型的损伤修复活性功能比较制备R S V 感染人支气管上皮细胞的损伤模型后，分组：R S V 感染模型阴性对照细胞组，R S V 稳定感染组。用显微视频分析系统测量缺损面积，收集所有时间点的缺损区域图像，采用B I 2 0 0 0 图像免疫组化分析系统，绘制时间与修复面积的直线回
13、归方程：Y = a + b X ，计算损伤修复指数( R t ，r e p a i ri n d e x ) ，R I 值等于回归方程中b 的绝对值( = Ib1 ) ，见图4 - 9 。结果显示，R S V 感染阴性对照组斜率绝对值较大，修复速度较快；R S V 感染模型组斜率绝对值较小，修复速4 5博士学位论文第四章人支气管上皮细胞感染R S V 后C F T R 变及上皮修复功能改变度较慢。提示R S V 感染H B E C s 后，H B E C s 的自身增殖、迁移及损伤修复能力较R S V 感染前，有所下降，这种潜伏感染状态，有可能引起支气管上皮细胞应激反应定式，其损伤修复功能发生
14、重塑，有可能形成反复发作的气道炎症和气道高反应倾向。鋈心意耋：弋图4 - 9R S V 持续感染人支气管上皮细胞模型的损伤修复活性功能比较4 4 讨论C F T R 是一种跨膜蛋白质，由5 个功能结构域组成：两个跨膜结构域，两个核苷酸结合结构域，一个调节结构域，属于A T P 结合盒转运体家族的成员，具有重要的功能。其中两个跨膜结构域构成了选择性氯离子通道，两个核苷酸结合结构域对氯离子通道的门控性起调节作用，调节结构域的磷酸化的作用则是控制通道活性。当它被蛋白激酶磷酸化时，将会促进两个跨膜结构域的二聚体化，进而激活C F T R 离子通道，还增加了对A T P 的结合和水解能力，起调节氯离子通
15、道的门控通道的作用。当C F T R 被激活时，排入腺体管腔中的A T P 能发挥其调节作用，从而激活一系列氯离子通道：而研究表明，在突变的囊性纤维化细胞中，C F T R 缺乏正常分泌A T P 以及氯离子的能力，从而不能激活这些氯离子通道了。所以，我们可以认为C F F R 并不是一个单纯的氯离子通道，而是一个多重离子通道及调控子的复合体。同时，作为一个阴离子通道，C F T R 还能调控上皮细胞钠离子通道( e p i t h e l i a ls o d i u mc h a n n e l ，E N a C ) ，此通道的活性依赖于C F T R ，并随着C F T R 活性的增加而
16、增强。使用电生理实验证明两种离子通道之间存在着协同作用，C F T R 的激活引起的氯离子运输增加也增强了钠离子通过E N a C 的能力。当C F T R 异常时，C 厂和水调节功能受阻，不能正常从血流进入黏膜下层，肺下部的黏液会变得非常浓稠，继发持续性的细菌感染。呼吸道C F T R主要表达于黏膜下腺中的浆液细胞中，浆液细胞分泌的电解质及C F T R 转运的液体可以发挥其清洁及防御功能，而C F T R 的功能缺陷会导致气道管腔的物质博士学位论文第四章人支气管上皮细胞感染R s V 后C F n t 的功能改变及上皮修复功能改变运送功能受阻，其含有更多的非蒸发性的固体成分，粘液的稠度增加，粘液清除率和粘液运输效率降低，容易诱发气道炎症和形成气道粘液栓。我们取对数生长期R S V 感染人支气管上皮细胞模型中阴性对照组细胞、R S V 持续感染后传代l 代细胞和稳定传代的模型组细胞，M Q A E 荧光染料法检测3 组细胞的细胞内氯离子浓度，制备标准品，检测标准品氯离子浓度，绘制氯离子浓度标准曲线，根据氯离子浓
