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1、土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性影响的研究一、课题背景及目的 在当代，人类对资源开发利用包括矿业开采等生产活动不断扩大，其作为一种 经济增长的一种重要手段，也引起了一系列经济、社会、环境等问题，不利于 可持续发展战略。人类活动及随后产生的废气物随意排放，不仅破坏和占用了 大量土地资源，同时也带来了一系列的环境问题如空气、地表水、地下水及土 壤的质量下降，生态系统和景观受破坏，生物多样性丧失，农作物减产等。这 不仅制约了国民经济的发展、加剧了人与自然的矛盾、破坏了人们的身心健康， 同时也不利于我国可持续发展战略的实施。 本研究目的了解土壤重金属对植物、土壤微生物及土壤酶活性的影响原理；掌
2、 握分析土壤理化性质、酶学性质、微生物量的能力。二、本课题研究的技术文献调研文献调研土壤处理土壤处理基质样本的采集基质样本的采集优势植物优势植物 样本采集样本采集理化性理化性 质分析质分析酶学性酶学性 质分析质分析微生物微生物 量测定量测定植物适应性评价植物适应性评价基质理化性质和生物学性质变化基质理化性质和生物学性质变化植物与基质性质关系分析植物与基质性质关系分析植物培养植物培养植物样本植物样本 室内分析室内分析三、具体实验步骤 1.具体实验操作具体实验操作 1.11.1从农田中取一定重量（50kg）的土壤，可选中一定区域，均匀设置取样点， 取土深度保持一致，记录取样地点，时间等； 1.21
3、.2风干后用2mm孔径的筛子进行过筛； 1.31.3对剩余土壤进行称重（此时剩余土壤总重量50kg） ； 1.41.4取土壤50kg将土壤平均分成5组； 1.51.5除对照组外，其余4组，分别与不同浓度梯度的CuSO4溶液混匀（Cu2+浓度梯 度为0mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、150mg/kg、200mg/kg） ，再将混匀后的土壤 平均分成5份； 1.61.6将这25份土壤装盆，在室内放置一周，并保持湿润； 1.71.7播种，每个盆中均匀种入油菜种子约30颗； 1.81.8植物生长过程中，保持各组生长条件一致，一定时间进行浇水，等到盆中油 菜长出第二片真叶，进行定植，每盆中
4、保留5-8株植物；在这期间，定期对植物 株高、叶片大小进行测量，记下数据； 1.91.9 植物生长一个半月后对植物以及土壤中的微生物和酶活性进行测定。2.样本室内分析样本室内分析 2.1.土壤中酶活性的测定土壤中酶活性的测定 实验中土壤酶的测定方法如下 2.1.1 土壤转化酶活性的测定土壤转化酶活性的测定-比色法比色法 2.1.1.1 试剂配制 （1）3，5二硝基水杨酸溶液：称 0.5g 二硝基水杨酸，溶于 20mL2N 氢氧化 钠和 50mL 水中，再加 30g 酒石酸钾钠，用水稀释至 100mL（不超过 7 天） 。 （2）pH5.5 磷酸缓冲液：1/15M 磷酸氢二钠（23.876g 磷
5、酸氢二钠.12H2O 溶于 1L 蒸馏水中）0.5mL 加 1/15M 磷酸二氢钾（9.078g 磷酸二氢钾溶于 1L 蒸馏水 中）9.5mL 即成。 （3）8蔗糖溶液：80g 蔗糖溶于 1000mL 水中 （4）甲苯 （5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在 80烘至恒重。然后取 500mg 溶于 100mL 蒸馏水中，即成标准葡萄糖溶液(5mg 还原糖/mL） 。再将次液稀释 10 倍 制成葡萄糖工作液(0.5mg/mL） 。 2.1.1.2 操作步骤 称取 5g 过 1mm 筛的风干土，置于 50mL 三角瓶中，注入 15mL 8蔗糖溶 液，5mL pH 5.5 磷酸缓冲液和 5 滴甲苯。摇
6、匀混合物后，放入恒温箱，在 37 下培养 24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液 1mL，注入 50mL 容量瓶中，加 3mL3，5二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热 5min，随即将容量瓶移至 自来水流下冷却 3min。溶液因生成 3氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用 蒸馏水稀释至 50mL，并在分光光度计上于波长 508nm 处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取 0、1、2、3、4、5、6、7mL 葡萄糖工作液，分别 注入 50mL 容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以 吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲
7、线。2.1.1.3 结果计算 以 24h 后 1g 土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）： SucaVn/m 式中：a 为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL） ；V 为显色液体积（50mL） ； n 为分取倍数；m 为烘干土重（g） 。 2.1.2 土壤过氧化氢酶活性的测定土壤过氧化氢酶活性的测定KMnO4 滴定法滴定法 称取 5g 新鲜土壤于 100ml 三角瓶中。加甲苯 0.5ml，摇匀，于 04冰箱放置 半小时。取出。立刻加入 25ml 冰箱储存的含 3% H2O2 的水溶液。充分摇匀后， 再放置 0-4冰箱半小时。取出立即加入 2N H2SO425ml，摇匀，过滤。取
8、 1ml 滤液，加 1N H2SO44ml，用 0.1N KMnO4 滴定。按此操作，用不加土壤的基质 作对照测定，并根据对照和试样 0.1N KMnO4 的滴定，求出相当分解的 H2O2 的量的 0.1N KMnO4 消耗值。 2.1.3 土壤脲酶活性测定土壤脲酶活性测定苯酚苯酚-次氯酸钠比色法次氯酸钠比色法 2.1.3.1 试剂配制： （1） pH6.7 柠檬酸盐溶液：取 368g 柠檬酸溶于 600mL 蒸馏水中，另取 295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用 1N 氢氧化钠将 pH 调 至 6.7，并用水稀释至 2L。 （2） 苯酚钠溶液：称取 62.5g 苯酚溶于少量乙醇中，加
9、 2mL 甲醇和 18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至 100mL（A 液） ，保存再冰箱中。称取 27g 氢氧化钠溶于 100mL 水中（B 液） ，保存于冰箱中。使用前，取 A、B 两液各 20mL 混和，并用蒸馏水稀释至 100mL 备用。 （3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为 0.9，溶液稳定。 （4） 10尿素溶液：10g 尿素溶于 100mL 水中。 （5） N 的标准溶液：精确称取 0.4717g 硫酸铵溶于水稀释至 1L，则得 1mL 含 0.1mgN 的标液，再将此液稀释 10 倍制成氮工作液 （0.01mg/mL） 。 2.1.3.2 操作步骤 称取 5土置于
10、50mL 容量瓶中,加 1mL 甲苯处理,加塞塞紧轻摇 15; 往瓶中加入 5mL10%尿素液和 10mL 的柠檬酸盐缓冲液(6.7),仔细混匀。在37恒温箱中培养 24。然后用热至 38的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液 1mL 置于 50mL 容量瓶中,用蒸馏水稀释至 10mL,然后加入 4mL 苯酚钠溶液,并立即加入 3mL 次氯酸钠溶液，加入每一试 剂后,立即将混合物摇匀,20后,将混合物稀释至刻度,在波长 578处测 定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲 线求出氨态氮量。 标准曲线绘制：称取 0.4717g 硫酸铵溶于
11、水中，稀释至 1L，则得 1ml 含 100ug 氮的标准溶液，绘制标准曲线时再稀释 10 倍使用。分别吸取 0-10ml 经稀释的 标准溶液于 50ml 的容量瓶中，用蒸馏水加至 10ml。然后加入 4ml 苯酚钠溶液， 立即加入 3ml 次氯酸钠溶液，充分摇匀，放置 20min。显色后稀释至刻度，用 1cm 液槽，在比色计上于 578nm 处测定颜色深度。以光密度值，对浓度绘制成 标准曲线。 2.1.3.3 结果计算 以 24 小时后 1g 土壤中 NH3N 的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）UreaVn/m 式中：a 为由标准曲线求得的 NH3N 浓度（mg/mL） ；V 为显色液体积
12、 （50mL） ；n 为分取倍数；m 为烘干土重（g） 。2.2 土壤中微生物量和呼吸作用的测定土壤中微生物量和呼吸作用的测定 2.2.1 微生物量 C熏蒸-浸提法 将经去除细根、杂质的新鲜土样，放入 28恒温培养箱中预培养 7 天后。称取 25g（精确至 0.0001）尾矿于培养皿中，将培养皿和盛有 50 ml 氯仿和 50 ml 1 M NaOH 的烧杯同时置入干燥器，用真空泵抽至氯仿沸腾并保持 2 min，后密封 置于 28恒温培养箱中熏蒸 24h，熏蒸结束后，取出氯仿和 NaOH，用真空泵 反复抽气直至土壤无氯仿味后。取出培养皿将土壤转入 250ml 三角瓶中，加入100ml 0.5m
13、olL-1K2SO4 在振荡器中振荡 0.5h，转速 180 rpm。取出迅速用无灰分滤纸过滤，滤液用于微生物量 C、N 的测定；同时做未熏蒸处理，取 25g（精确至 0.0001）相同土壤，直接加入 100ml 0.5molL-1K2SO4 在振荡器 中振荡 0.5h，转速 180 rpm。取出迅速用无灰分滤纸过滤，滤液待测。 微生物量 C 的测定方法：取 8ml 上述滤液，加入 0.067M 的重铬酸钾 2ml，加 入 70mg 氧化汞和浓硫酸、浓磷酸混合液（V 硫:V 磷=2:1）15ml。在 170下 回流冷凝 0.5h，最后用标定的硫酸亚铁铵溶液来滴定反应液，同时做未熏蒸和 蒸馏水空
14、白对照 2.2.2 呼吸作用的测定呼吸作用的测定氢氧化钠吸收法氢氧化钠吸收法 称取约 30g 左右的新鲜尾矿（相当于风干土 25g）放入 1000ml 的广口瓶中，在 一离心管中加入 25ml 0.1 molL-1NaOH 将其吊在光口瓶塞得下方，塞紧瓶塞 （注意 NaOH 不能与尾矿接触） ，并做几个无土对照。将其一并放入 37恒温 培养箱培养培养 24h，将离心管取出迅速用硼砂标定过的 0.1 molL-1HCl 进行 滴定。最后用空白消耗的 HCl 体积与样品消耗的 HCl 体积差来计算土壤呼吸作 用。2.3.植物中金属含量测定植物中金属含量测定 2.3.1 植物金属含量测定植物金属含量
15、测定 待测液的制备：称取磨细烘干的植物样品 1.0000g，置于 150ml 三角瓶中，先用 少许水润湿，加入 5ml 酸混合液（V 浓硝酸:V 浓硫酸:V 高氯酸=8:1:1）浓硫酸 浸泡过夜。次日在瓶口放一弯颈漏斗，在电热板上先低温缓慢加热 40min 后， 逐渐提高温度待植物样品大部分变白后高温消煮，待高氯酸分解冒白色浓烟后 2-3min 分解完全，此时三角瓶中硫酸冷凝回流，冒缕状白烟，溶液呈亮清色。 取下三角瓶，冷却后用 10%HCl 洗涤小漏斗，将洗涤液和消煮液一并转入 50ml 容量瓶中。待测。测定用 ICP 进行。四、数据处理 油菜在不同浓度的铜离子下的生长情况 油菜茎长（平均值
16、）单位：cm样本编 号第一 个星 期第二个 星期第三个 星期第四个 星期第五个 星期第六个 星期第七个 星期0-12.32.42.833.13.13.1 0-22.22.52.73.13.23.23.2 0-32.32.42.73.23.43.43.4 0-42.12.32.633.33.43.5 0-52.22.32.53.23.23.33.3 50-122.22.63.23.43.53.5 50-22.22.32.53.43.53.53.5 50-32.32.42.73.33.53.63.6 50-42.22.52.83.43.53.53.5 50-52.32.42.73.23.43.53.5 100-12.42.62.83.53.63.73.7 100-22.32.52.83.43.53.53.5 100-32.22.42.63.33.53.63.6 100-42.42.52.83.23.43.53.6 100-52.32.42.73.33.43.53.5
