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1、前列腺癌细胞膜抗原（前列腺癌细胞膜抗原（PSMA）通过激活）通过激活 MAPK 途径调节途径调节 IL6 和和 CCL5 的表达的表达摘要摘要IL6 和 CCL5 和很多种肿瘤的发生和发展有关，包括前列腺癌的发生。在前列腺癌后期或者肿瘤发生转移的过程中，PSMA 的表达量有所增加。临床研究表明，前列腺癌细胞过量分泌 CCL5 和 IL6 与 PSMA 的高表达具有一定的相关性。我们假设，PSMA 具有信号转到的能力，它的积累能够调节 CCL5 和 IL6 的表达。因此，我们通过特异的抗体证明 LNcap 细胞中 PSMA 激活小 GTP 酶和RAS、RAC1 以及 MAPK p38 和 ERK
2、1/2 途径。伴随着 IL6 和 CCL5 的高表达进一步诱导了 NF-k B 的激活。药物阻止实验也表明，p38 和 ERK1/2 都参与了这一过程，p38 的表现尤为明显。结论，IL6 和 CCL5 通过受体介导激活 STAT5-细胞周期因子 D1，从而明显的增加了 LNcap 细胞的增殖能力，并具有明显的剂量依赖效应。最新的研究认为，PSMA 作为前列腺癌细胞表面受体影响着癌细胞的生长和增殖，PSMA 的过度表达与较差的预后具有相关性。前言前言前列腺癌是发达国家男性人群中最为普遍的癌症之一，并且这种雄激素敏感型肿瘤导致的病人死亡率非常高。目前已经有研究表明，在肿瘤生长的微环境种，存在一些
3、可溶性的介质在肿瘤细胞的生长和增值过程中起着关键作用。在所有这些介质中 IL6 在调节细胞增殖、凋亡、血管再生以及细胞分化过程中起着重要作用，和肿瘤的发生和发展有关，包括前列腺癌。事实上，在前列腺癌细胞株、分离的新鲜前列腺癌细胞和良性的前列腺增生细胞都在表达 IL6 及其受体。临床发现，在很多通过雄激素控制难以治疗的前列腺癌患者血清中 IL6 的含量显著升高甚至超高。而且，IL6 能在体外激活 LNcap 细胞雄激素受体介导的基因表达，表明 IL 可能在前列腺癌的发展过程中起着关键作用。另外，在雄激素依赖性 LNcap 细胞中 IL6 的过量表达进一步提高了细胞雄激素非依赖能力。最近，在前列腺
4、癌细胞中发现 CCL5 增强了癌细胞的增殖和侵袭力。因此，CCL5的表达和前列腺癌的行为肯能直接相关。IL6 和 CCL5 的表达主要受转录水平的调控，通过转录因子 NF-k B 以及包括 AP1 在内的至少五种转录激活因子的联合作用。NF-k B 和 AP1 的联合作用对于雄激素非依赖型前列腺癌细胞合成表达 IL6 具有重要意义。基因诱导表达取决于多种多样的细胞表面受体激活独特的或部分的细胞内信号传导途径，作用于 MAPK 激酶的磷酸化位点（例如P38、ERK1/2、JUNK 等）从而激活 IL6 和 CCL5 基因的转录表达。细胞因子，生长因子受体，粘附分子以及很多其他的细胞表面分子都能有
5、效地促进或下调IL6 和 CCL5 的表达。另外，经过长时间的治疗，IL6 能够激活自身基因的表达，而且在前列腺癌细胞中，自分泌和旁分泌 IL6 以及 TGF-beta 调节着细胞的增殖，生长以及分化过程。PSMA 的表达水平被认为是前列腺癌恶化程度的有效指标。PSMA 是一个二型膜整合蛋白，主要表达于前列腺表皮细胞，具有叶酸水解酶以及羧肽酶活性。在正常的前列腺细胞中表达量很低，而在晚期前列腺癌细胞以及转移性前列腺癌细胞和雄激素不敏感前列腺癌细胞中大量表达，表明 PSMA 是一个重要的前列腺癌诊断和治疗靶点。 临床发现，在前列腺癌晚期 IL6 的产生和 PSMA 的表达之间肯能有一定的相关性。
6、因此，在本文中我们研究了前列腺癌细胞表面PSMA 分子和 IL6 基因的表达之间可能存在的功能性关系。我们同样研究了CCL5，因为它具有和 IL6 相同的诱导机制和促进细胞增殖能力。最近通过沉默、抑制或者敲除 PSMA 基因发现，PSMA 通过激活 LNcap 粘附激酶（FAK）或者激活正常的内皮细胞（HUVEC）p21 激酶（PAK1）调节粘附/去粘附过程从而证明了 PSMA 是一类具有信号转导功能的分子的假设。本文通过刺激而不是抑制或者沉默 LNcap 细胞 PSMA 基因的表达来研究 PSMA 配体，主要方法是通过特异性抗体和 PSMA 分子胞外部分的交联。本文中，通过研究雄激素非依赖性
7、 LNcap 细胞我们第一次证明了抗体介导的PSMA 交联诱导了 IL6 和 CCL5 基因的表达。基因诱导表达的发生是因为一系列的激活过程包括 RAS、RAC1、P38 和 ERK1/2MAPKs，最终导致转录因子NF-k B 的亚单位 p65 的磷酸化。另外，IL6 和 CCL5 协同作用使得 LNcap 细胞的增殖能力最大化。而且，我们发现 CCL5 诱导 LNcap 细胞的增殖和 STAT5以及细胞周期蛋白 D1 的表达有关，而这一途径控制着正常前列腺细胞及前列腺癌细胞的生长周期。PSMA 新功能的发现表明 PSMA 在前列腺癌细胞生长过程中是一种重要的调节分子。材料与方法材料与方法化
8、学试剂，培养基及抗体化学试剂，培养基及抗体PD098059和SB202190抑制子由Calbiochem- Novabiochem (San Diego, CA)提供；多聚D-赖氨酸，胰蛋白酶，蛋白酶抑制剂购自SIGMA公司；苯甲基磺酰氟，抗蛋白酶，大豆胰蛋白酶抑制剂购自Roche公司。PVDF尼龙膜以及ECL western blotting 检测系统购自Amersham公司。RPMI1640培养基以及谷氨酰胺购自Societa Prodotti Antibiotici 公司。FBS购自Celbio， （Fab）2羊抗鼠Ig以及抗-VCAM-1购自Immunotech；FITC-标记（Fab
9、）2羊抗鼠Ig以及抗磷酸化p65的m Ab购自Becton Dickinson公司；抗PSMA m Ab J591由H.Liu指导，Dr. N.H.Bander提供；7E11c m Ab，从杂交瘤细胞HB-10494悬液中纯化得到； 抗磷酸化p38，抗p38多克隆抗体以及抗磷酸化ERK1/2m Ab通过Cell Signaling Technology获得；抗STAT5以及抗细胞周期蛋白D1多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology；抗-RAS和抗RACm Ab来自Upstate Biotechnology； 试验中用到的抗PSMA单克隆抗体有本实验室自己制备，通过亲和层析
10、纯化。可溶重组PSMA免疫BALB/c小鼠，通过标准的融合程序获得杂交瘤细胞。杂种细胞通过流式细胞仪和PSMA阳性细胞（LNcap细胞）以及PSMA阴性细胞株（DU145、PC3）比对进行筛选。生物化学方法生物化学方法LNcap细胞在含有2.5%的FBS培养基中培养过夜，再血清饥饿2h后制备细胞提取液，蛋白总量通过考马斯亮蓝分析定量。RAS活性通过RAS活性检测试剂盒（Upstate Biotechnology）进行分析。将经过处理的和未经处理的细胞在缓冲液中冰上裂解30分钟，缓冲液配方为25m M Hepes，PH7.5， NaCl 150m M， 10%Glicerol， Na ortho
11、vanadate 1 mM， Na pyrophosphate 50n M，Na fluoride 25m M， MgCl 10m M ，1%NP40，磷酸酶和蛋白酶抑制剂。取细胞裂解液250ug，加入10ulGST-Raf-RAS结合域（Upstate Biotechnology）在4条件下琼脂糖固定1小时。用裂解缓冲液冲洗玻片，2SDS样品缓冲液重悬，然后SDS-PAGE。抗RAS单克隆抗体孵育后玻片经过连接有辣根过氧化物酶的二抗处理，ECL凝胶检测系统进行分析。RAC1活性通过RAC1活性分析试剂盒（Upstate Biotechnology）测定。 取250ug细胞裂解液加入10ulG
12、ST-PAK-1-RAC-BD，4琼脂固定1小时。玻片经过裂解缓冲液冲洗，2SDS样品缓冲液重悬，然后SDS-PAGE。抗RAC抗体(Upstate Biotechnology)进行WB分析。为了检测p38和ERK1/2的磷酸化，没有处理的和处理过的细胞通过上述裂解液处理后，取等量的总蛋白在样品缓冲液中煮沸，然后SDS-PAGE。分别用抗磷酸化p38抗体和抗p38抗体，抗磷酸化ERK1/2抗体和抗ERK1/2抗体孵育后，玻片经过连接有辣根过氧化物酶的二抗处理，ECL凝胶检测系统进行WB分析。底片的光密度可以通过激光显像密度计计算和分析。细胞内特定位点磷酸化的流式细胞仪分析细胞内特定位点磷酸化的
13、流式细胞仪分析抗PSMA单克隆抗体处理LNcap细胞室温下30分钟后，分别用羊抗鼠抗体在37条件下处理0,15,30min。在室温下细胞用固定缓冲液固定10min，然后50%冰甲醇透析30min，经过固定和透析的细胞玻片冲洗两次，用含有2%FBS的磷酸缓冲液重悬，抗NF-k B磷酸化的单克隆PE聚合抗体室温下孵育30min。同型共轭配对，没有配对的单克隆抗体作为对照。流式细胞仪(Becton-Dickinson)检测荧光信号，FlowJo软件进行数据分析。IL6和和CCL5定量分析定量分析ELISA试剂盒处理细胞裂解液，测定OD值后通过标准曲线计算IL6和CCL5的含量，单位为pg/ml。最后
14、换算为pgIL6或者CCL5/mg蛋白裂解产物。细胞增殖分析细胞增殖分析LNcap细胞在1%FBS培养基中培养48h后用一定剂量的重组CCL5和IL6处理（Endogen） 。抗PSMA单克隆抗体处理以及抗PSMA或者7E11c的交联已经在细胞及细胞处理部分讲明。在CCR5的处理过程中，在加入CCL5之前抗体在37条件下提前孵育2小时。在最后的12h细胞悬液中加入1u Ci甲基-3H胸苷（3H-TdR）(6.7Ci/mmol)。将细胞收获到玻璃纤维筛选器上通过-光谱仪进行放射线筛选。结果表示为没有经过处理的对照组细胞的百分数。流式细胞仪分析流式细胞仪分析细胞经过饱和的抗体冰上孵育1h后，用预冷
15、的RPMI培养基冲洗三次，加入2ulFITC标记的羊抗鼠抗血清冰上孵育1h，洗涤后用流式细胞仪分析（Becton Dickinson）数据统计分析数据统计分析结果数据的统计与分析采用参数非配对t检验法，P0.05,分别在抑制剂浓度为 25UM 和 50UM 时） ，而在抑制 PSMA 交联诱导表达 IL6 过程中几乎没有任何作用。因此，在两种抑制剂同时存在的情况下，IL6表达较少的量和只有 SB 存在的情况下相同。CCL5 的实验结果和 IL6 相同。如图 4B 所示，在抑制剂 SB 存在的情况下，CCL5 的本底表达量减少情况存在剂量依赖效应，在抑制剂浓度为 50UM 时减少最为明显(45%
16、12 p0.01)。PSMA 诱导的 CCL5 表达量在抑制剂 SB 浓度为 25UM 时抑制效果最为明显而在 50UM 时其本底水平表达几乎为零。同样，ERK1/2 抑制剂 PD 对 CCL5 的影响也很有限。PD对 CCL5 的本底水表达几乎没有影响，对 PSMA 诱导 CCL5 的表达抑制虽然显著（p0.001） ，但也仅仅使其表达量减半，没有抑制剂剂量依赖效应（） 。在25UM 时将两种抑制剂混合使用并没有发现更强的抑制能力。可能的原因是混合抑制剂在更高的浓度时其抑制效果不能被有效检测到，因为当抑制剂浓度到达100UM 时抑制剂本身会发生凝聚和沉淀。抑制剂 SB 和 PD 对 IL6 以及 CCL5 基因表达的影响和未经处理的细胞组相似（见图 4A 和 B） 。图 4 表明，在 LNcap 细胞中 PSMA 的交联通过激活 p38 和 ERK1/2 从而调节了IL6 和 CCL5 基因的表达，在其他正常上皮细胞或者病理细胞中相同。另外，我们还发现在调控 IL6 和 CCL5 基因表达上 p38 表现的比 ERK1/2 作用更广、活性更强。IL6IL6 和和
