生物工程的灭菌技术

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1、1生物工程的灭菌技术生物工程的灭菌技术 麦浩荣 (广东省石油化工设计院 广州 510130)摘要：本文重点介绍了发酵工程中培养基及有关设备、物料和空气管道的灭菌技术， 确保达到无菌要求，满足纯种发酵。并且对阀门的选用做了简单的介绍。关键词：发酵、灭菌、无菌一前言生物工程是当代科技的高新技术，是 21 世纪 最具发展潜力的产业。生物工程最大的特点在于 充分利用生物物质资源，节约能源，易于实现洁 净生产，而且可以实现一般化工技术难于实现的 化工过程。本人参与一项生物工程的设计工作， 该工程是根据科研成果直接设计转化为工业化大 规模生产装置。所生产的产品为透明质酸聚合物 (PHA),为生物可降解塑料

2、产品的添加剂。设计主要 是根据中试结果进行放大设计。该生物工程包括 配料、发酵、絮凝、压滤、造粒、提取、产品干 燥回收、溶剂回收等工序。其中配料与发酵属于 生物工程，而絮凝及后面的工序属于化学工程。 这里主要介绍发酵工程的灭菌技术。常用的发酵 工艺流程图见图 1 所示。图 1 典型的微生物分批培养工艺流程图 二灭菌技术生物化学工程是运用化学工程的原理和方法 对实验室所取得的生物技术成果加以开发，使之 成为生物反应过程的一门科学，是以活的细胞为 催化剂或由细胞提出来的酶为催化剂的反应过程。 所以必须进行纯种培养，也就是只允许生产菌存 在和生长繁殖，不允许其他微生物共存。因为生 物反应系统中通常会

3、含有丰富的营养物质，易受 杂菌污染，会产生以下不良的后果： 如果受到杂菌污染，会使生物反应基质或 产物因杂菌消耗而损失，造成生产能力下降； 由于杂菌产生的一些代谢产物，或者杂菌 改变了发酵液的某些理化性质，使产物的提取变 得困难，造成收得率降低或使产品质量下降； 污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的 pH 值，从而使生物反应发生异常变化； 发生的噬菌体污染，使生产菌细胞裂解， 而使生产失败等等。 所以整个发酵过程必须强调无菌操作，牢固 确立无菌观念。除了设备应严格按规定要求，保 证没有死角，没有构成感染可能的因素外，必须 对培养基和生产环境进行严格的灭菌和消毒，防 止杂菌和噬菌体污染，达到无菌

4、要求。必须注意 几方面：菌体无杂菌，培养基及有关设备管路彻 底灭菌，设备严密，空气灭菌。2.1 培养基灭菌培养基灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力 的细菌营养体及其孢子，或从中除去之。工业规 模上的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更 为常用，其中热灭菌最为简便、有效和经济。对于液体培养基的热灭菌，工程上所要解决 的课题是：将培养基中的杂菌总数 N0杀灭到可以 接受的总数的 N，需要多高的温度，多长的时间 为合理，这决定与杂菌孢子的热死灭动力学，反 应器的形式和操作方法，还决定于培养基中有效 成分受热破坏的可接收范围。 2.1.1分批灭菌 微生物受热被杀死，主要原因是高热能使蛋 白质变性。这种反

5、应属于单分子反应，死亡速率 可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。 即： - dv/dt=kN (2.1) 式 中 N 为任一时刻的活细菌浓度，个/L；t 为时间， min；k 为比热死速率常数，min-1。对式(2.1)积分，取边界条件 t0=0,N=N0，得： lnN/ N0=-kt 或 N= N0e-kt (2.2) 维持灭菌温度 T 不变，经历不同的灭菌时间，2检测相应的 N 按 lnN/ N0对 t 作图，如图 2 所示。 直线的斜率为 k，k 除了决定与菌体的抗热性能之 外，还明显地受灭菌温度 T 的影响。图 2 大肠杆菌的失活 细菌孢子的热灭动力学与营养体细胞的有所 不同。

6、如图 3 所示。图 3 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热死速率 从图 3 可以推测，细菌孢子壁具有较大的热 阻。但霉菌孢子的热阻比细菌的小的多(见表 1)， 这可能与孢子壁的化学成分及结构有关。当温度 超过 120时，热阻极强的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 的热死灭动力学也接近与一级反应规律。表 1 典型发酵环境中各种微生物对温热灭菌的相对热阻 生物体种类相对热阻 营养细胞和酵母1.0 细菌孢子3x106 霉菌孢子210 病毒与噬菌体15 由表 1 可以得知，对培养基进行灭菌必须以 细菌孢子为杀灭对象。营养细胞易于受热死亡， 表明其热死速率常数 k 值很高，在 120灭菌，其 k 值可大至 1010(min-

7、1)数量级，而细菌孢子的 k 值 在 120时只有 100数量级。 k 除了决定菌体的种类及存在形式外，还是温 度 T 的函数。由于微生物的热死灭接近于化学反 应的一级动力学，因此，比热死灭速率常数 k 与 灭菌温度常数 T 的关系可用阿累尼乌斯方程来表示。即k=Ae-E/RT （2.3）或 lnk=lnA-E/RT （2.4） 式中 A 为频率因子，s-1, E 是死亡活化能， J/mol； R 为通用气体常数，J/molK。 对式（2.4）两边求导， 得 dlnk/dT=E/RT2 （2.5） 由式（2.5）可知，反应的 E 愈高，lnk 对 T 的 变化率愈大，亦即 T 的变化对 k 的

8、影响愈大。 培养基灭菌既要杀死杂菌的孢子，又要保存 其中的有效成分。试验证明，细菌孢子热死灭反 应的 E 很高，而有些有效成分热破坏反应的 E 较低，因而提高灭菌温度 T 会加快细菌孢子的死 亡速率，从而缩短高温下的灭菌时间，由于其他 有效成分的热破坏 E 很低，温度提高只能稍为 增大其热破坏程度，但灭菌时间的显著缩短，其 结果是有效成分的破坏量反而大为减少。 2.1.2分批灭菌设计 工程上要求绝对无菌是不可能的，但只要是 培养基中的杂菌减低到合理的程度就可以了。对 于周期长，成本高的发酵，常取灭菌后一罐培养 基中残存的活菌孢子数 N=10-3个，即灭菌 103次， 存活一个活菌孢子的机会为

9、1 次。N/N0是灭菌程 度指标，不同的发酵体系有不同的 N/N0。在分批 灭菌中，为计算方便，取 ln N0/N 为设计依据，如 培养基 1000m3，含菌 106个/ml，要求灭菌后，活 菌数 N=10-3个。 则 N/N0=10-3/(1000x106x106)=10-18 lnN/N0=41.45 分批灭菌也称实罐灭菌，全过程包括升温、 保温、降温三个阶段。三个阶段分别对孢子的死 灭和培养基中有效成分的破坏做出大小不同的贡 献。其典型的 T-t 图如图 4。灭菌主要在保温过程 实现，但升温的后期和冷却的初期培养基的温度 高，因而亦有一定的灭菌效果。3图 4 分批灭菌时典型的温度变化孢子

10、受热死亡规律符合-dv/dt=kN，故 lnN0/N=kt； lnN0/N=)ln(22110 NN NN NN=lnN0/N1+ lnN1/N2+ lnN2/N lnN0/N 是由三块面积 lnN0/N1，lnN1/N2，lnN2/N 合成的。可以合理设计 这三块面积的大小，使其和等于 lnN0/N 的预定值。 然而分批灭菌的 T-t 过程不是任意给定的。它取决 于加热方式，换热面积的大小，传热系数的高低， 换热介质的温度培养基的质量等诸多因素。要尽 可能加快换热速度，以尽可能缩短升温和冷却的 时间，延长保温时间，以达到细菌孢子的杀灭和 培养基中有效成分的最大保留。 在本设计中，一、二级种子

11、罐灭菌是采用实 罐灭菌的方式来进行的。 2.1.3 连续灭菌 连续灭菌的加热、保温和冷却三个阶段是分 别在不同的专有设备中进行。由于培养基能在短 时间内加热到保温温度，并能很快被冷却。因此， 可在比分批灭菌更高的温度下灭菌，灭菌时间缩 短，这有利于减少营养物质的破坏。连续灭菌所 用蒸汽压力一般高于 5x105Pa(表压)。 图 5、图 6 两种基本的灭菌装置。图 5 是由管 式或板式换热器把培养基间接加热和冷却；图 6 则用蒸汽把培养基加热到灭菌温度，经保温后， 再进行闪急冷却。图 5 板式热交换器连续灭菌装置图 6 蒸汽喷射连续灭菌装置 第一种方式的特点是单位体积的热交换器具 有较高的传热面

12、积，且可根据生产需要，改变其 换热面积的大小。第二种方式是用蒸汽直接喷射 物料，被加热的物料通过保温，最后用闪急膨胀 法冷却。其特点是加热、冷却极为短暂，缺点是 培养基被蒸汽的冷凝水稀释。 在本设计里，培养基的灭菌采用了以上两种 方式的组合形式，并加以改进，流程见图 7。图 7 配料液连续灭菌流程图 1，4板式换热器；2连消塔；3维持罐 在该流程中，蒸汽直接通进连消塔，使配料 液的温度迅速提高，并在维持罐内保温，既缩短 了灭菌时间，也省去了闪急冷却装置。 2.2 空气除菌 在发酵过程中，微生物的生长和繁殖需要大4量的氧气，这就需要输入大量的空气来提供氧气。 在空气中的微生物多为细菌、细菌孢子，

13、也有真 菌、酵母和病毒。其大小从几个微米到几百微米 不等(表 2)，小的微生物附在空气中的灰尘上，灰 尘的平均尺寸约为 0.1m。粗滤器可将粗的微粒 除去，0.52.0m 的微粒及细菌微生物由空气过 滤器除去。 表 2 空气中细菌及细菌孢子的代表种类 菌种宽，m长，m 产气气杆菌1.01.51.02.5 蜡状芽孢杆菌1.32.08.125.8 地衣芽孢杆菌0.50.71.83.3 巨大芽孢杆菌0.92.12.010.0 枯草芽孢杆菌0.51.11.64.8 金黄小球菌0.51.01.03.0 普通变性杆菌0.61.20.91.7 空气中微生物的数量与温度及其他环境条件 有关。城市空气中的微生物

14、密度比农村和山区高。 空气中微生物数量级为 103104微粒/m3,每提高 2.5m，空气中的微粒数可减少一个数量级。 2.2.1空气除菌方法 加热灭菌 虽然细菌孢子耐热性很强，但 在较高的温度时也能使之破坏。可以利用空气被 压缩时所产生的热来灭菌，为了保证压缩后的空 气具有较高的温度，在压缩空气出口管包裹保温 层。在单级绝热压缩机(3kg/cm2)运转时，吸进的 空气为 20或 27时，则压缩后出口空气的温度 分别上升到 150或 270。这种灭菌方法必须保 持有足够的灭菌时间，为了彻底除菌，必须在罐 前安装一个空气过滤器。 辐射灭菌 波长 226.5328.7mm 的紫外线 对空气中微生物

15、的杀菌效力最强。但设备投资高， 在发酵工业中还很少应用。 化学灭菌 使空气在杀菌剂溶液中通过或 喷洒于空气中的微生物，但必须除去带杀菌剂的 水气和雾后才能应用，工业生产中也很少应用。 静电除尘 静电除尘的特点是能量消耗少， 空气的的压头损失小，约为 4002000Pa；对1m的尘粒捕集效率可达 99%以上。缺点是设备 庞大。 介质过滤 发酵工业制备无菌空气广泛采 用纤维过滤器。在本工程设计中，就是采用玻璃 纤维过滤器加金属过滤器来制备无菌空气。 2.2.2空气除菌流程 比较理想的空气除菌流程应具备以下特点。高空采风，吸气风管设置在工厂上风向高 2030m 处，减少吸入空气的细菌含量。 在空压机

16、空气入口处安装中效或高效前置 过滤器，以减轻总过滤器的负荷。 采用无油润滑压缩机，减少压缩后空气中 的油雾污染， 压缩机后采用冷却型的空气储罐，可降低 空气的温度，同时除去部分润滑油。 采用二级冷却二级旋风分离器，使油水分 离较完全。 采用旋风金属网除雾器，除去空气中的雾 滴。 用蒸汽加热器将空气加热至约 50，使空 气的相对湿度低于 60%，再进入总过滤器以保证 总过滤器维持干燥状态。 空气经总过滤器后进入分过滤器，再进入 发酵罐，空气的除菌程度达到 99.999%。 图 8 是一个典型的除菌流程，在本设计中基 本上采用该流程。图 8 两级冷却、加热除菌流程图 1粗过滤器；2压缩机；3贮罐；4，6冷却 器；5旋风分离器；7