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1、生物技术在香精香料生产中的应用生物技术在香精香料生产中的应用天然香料不断增长的市场需求,促进了香精香料生产技术的迅速发展。尽管传统的化学合成和天然提取方法还在起重要的作用,但是利用生物技术生产香料化合物正受到人们越来越多的重视。利用微生物发酵来模拟植物次级代谢过程可生产出香料化合物,而且这些香料化合物已被欧洲和美国食品法规界定为“天然的”。这种标识体现着市场的一种强烈要求。1 历史自从啤酒、葡萄酒和乳酪等相关发酵产品的问世,微生物发酵过程一直在食用复杂香味物质的发展中起着重要的整合作用。当代生物技术已从手工工艺进化到大规模工厂化生产。150 年前,苯甲醛是第一个被鉴定的香料化合物(1837)1
2、,而香兰素的分离、鉴定和合成标志着当代香料工业真正的开始(1874,1876)1,第一篇有关微生物香料的综述发表于 1923 年2。早在十九世纪五十年代初,经典的有机分析方法就被刚刚发明的气相色谱所取代,这一技术也促进了挥发性化合物的分离和结构鉴定发展。近年来,有关利用微生物生产香精香料的文章发表越来越多(1993,1996,1995)3-5。早期的研究主要集中在筛选可产生芳香化合物的微生物菌种上,而现今微生物技术(包括基因工程),正越来越多地应用于提高生物催化剂的催化效率。全世界香精香料工业的规模是巨大的,1994 年估计有 97 亿美元,同时约有 6400 种天然香料和 10000 种合成
3、香料为人们所掌握。其中常用的有几百种,每年生产规模在 1 吨以上的香料约有 400 种。现在,每年有几千吨非挥发性香料化合物,如甜味剂、酸味剂和咸味物质是通过生物技术生产的。尽管生物工程应用于挥发性香料化合物的研究只是最近才成为热点(1994)6,但是进入工业化生产的产品已经存在,主要为脂肪族羰基化合物、羧酸酯和苯甲酸酯,包括内酯、香兰素和一些特殊化合物(1996)7。2 香料生物技术使用香精香料的产品(如方便食品、饮料、化妆品、去污剂)不断增长的市场份额要求业内企业要有全新的策略来生产芳香化合物。全世界约有 80%的香精香料是由化学法合成的,然而在德国(1990 年)约有 70%的食用香料是
4、天然的(.)1,这一趋势要归功于新型营养健康生活观念的建立。上述“天然的”标记对于利用微生物技术生产香料的研究是非常重要的,因为天然的和化学合成的香料在价格上差距是巨大的,例如每公斤合成香兰素的价格为 12 美元左右,而每公斤从香荚兰豆提取的香兰素是 4000 美元。此外,生物技术还会显现出其它的优点,香料是生物活性物质,手性对其香味具有重要的影响,而生物催化剂可选择性地催化合成出手性化合物。生物技术进一步的优点是: 1.独立于农业之外,可不受于地方不利环境条件所限制。 2.可利用工程技术方法进行放大和工业化生产,产品易于回收。 3.可为发展中国家保护天然资源。2.1 由代谢路径到目标香料化合
5、物高等植物精油、果汁、植物提取物和一些少量的动物,长期以来是天然香料的唯一来源,而生物技术主要包括微生物、植物细胞和酶的单步生物转化和从头合成,完整细胞可用于复杂目标化合物的生物催化合成,而游离酶可用于单步反应过程的催化。在微生物中,真菌(特别是担子菌)所产生的挥发性物质与植物挥发物质极其相似,许多真菌挥发性物质已经被确定,结构上也等同于高等植物香料。2.1.1 从头合成完整微生物细胞可催化完成碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢过程,且可将降解后的化合物转为更复杂的香料化合物分子。普通的发酵培养可产生大量的初级代谢产物和微量的复杂芳香化合物。例如在乳品中乳酸大量产生的同时,一些微量的挥发性香料,如
6、短链醇、醛、酮、甲基酮以及吡嗪、内酯、硫醇类化物也伴随着产生。乳酸的生成也无需多论,但如何通过发酵工程技术提高潜在香料化合物还需进行深入的研究,然而,这方面的研究进展受到代谢规律缺乏的限制。可能有效的方法是通过代谢流的研究结合酶的诱导、反馈调节、分解代谢物的调节以及能荷调节来达到促进香料化合物的生物合成。2.1.2 生物转化和生物合成:价廉易得的可再生的天然前体物,如脂肪酸和氨基酸,可以通过微生物发酵和酶工程技术转化为高附加值的香料化合物。生物催化优于化学催化主要在于: (1)手性的引入, (2)化学惰性碳原子的功能转化, (3)在多功能分子中选择性修饰特定的基团, (4)手性香料化合物的拆分
7、。下面就最近研究热点中的几种香料化合物生物技术运用作一介绍。.单萜单萜在自然界中广泛存在约有 400 种结构,组成了一群合适的前体底物,土壤细菌和高等真菌可将其转化为非环、单环、双环的类单萜化合物,到目前为止,大多数单萜的生物转化只停留在研究上,暂且不具有实质商业价值,主要的问题在于: (1)单萜前体化合物和产物的化学不稳定性。 (2)单萜化合物的低水溶性。 (3)前体和产物的高挥发性;前体和产物的高细胞毒性。 (4)低转化率。.高萜/萜类化合物高萜生物转化中,萜类前体化合物的细胞毒性不再是个主要障碍,转化率和产率就相应有所提高。例如广藿醇被土壤微生物选择性羟基化,转化为 10-羟基广藿酮,产
8、率在 1.2-1 左右。10-羟基广藿酮再由化学法转化为降绿叶烯醇,此为广藿香精油中的一种主要成份(1981)8(1993)9。研究报道利用真菌可将 -紫罗兰酮转化为烟草香料。.香兰素香兰素是一种被广泛接受的香料化合物,主要存在香荚兰豆中,含量为 7%左右,目前国际市场上只有 0.2%香兰素是天然的,其余都是化学合成的。受货源限制和高昂价格的趋使,生物转化法得到广泛的研究。目前,植物细胞培养和微生物转化法都不能提供一个可以接受的转化率。前体化合物法似乎更有前景。几种合适的起始原料包括:木素,丁子香酚、阿魏酸、姜黄素和泰国安息香树脂。转化率 30%左右,产率 1-1 左右已有研究报道。前体化合物
9、和产物的毒性以及产物在发酵过程中的降解,都会影响最终产品的得率。 .苯甲醛在数量上,苯甲醛是第二大主要的香料,天然的苯甲醛通常来源于苦杏仁核,而在生产过程中同时产生的等摩尔氢氰酸可能会引起严重的安全问题。最近科学家发现利用微生物转化天然的苯丙氨酸可合成出苯甲醛,这就为苯甲醛的生产提供一条新的途径。此过程的研究开发正在充足廉价的天然苯丙氨酸保证下进展顺利。-苯丙氨酸的微生物代谢过程的研究有助于避免副反应而提高生物转化效率。有人曾用次-苯丙氨酸特异标记来阐述的深层发酵代谢路径,通过研究可知苯丙氨酸通过两个不同的降解途径可完全转化为香料化合物苯甲醛和苯丙醇。-苯丙氨酸通过氧化降解途径转化为苯甲醛同样
10、也被发现于细菌的代谢过程中。 .癸内酯内酯是一种常用的挥发性香料。脂肪族链烷酯作为重要的食用香料是源于它们特殊的味感特性。癸内酯是一个重要的组份,存在于许多水果中,如草莓、桃子和杏以及奶制品和一些发酵食品。随着八十年代内酯生物生产过程的建立,天然癸内酯价格从 20000美元/降到 1200 美元/。通常,微生物内酯是通过羟基脂肪酸的 -氧化生产的,此转化过程的产品得率为 5-1。2.1.3 游离酶到目前为止,约 3000 种酶在文献中被报道,但只有几百种可商业化生产,且其中仅 20 种适合于工业生产过程,脂肪酶、酯酶、蛋白酶、核酸酶和糖苷酯酶可用于香料化合物的提取过程,而且还可将大分子前体化合
11、物水解为小分子香料物质,一个很好的例子是脂水解反应的逆反应即脂肪酶非水相酯化反应。这些酶还可用于脂肪族酯、芳香酯和内酯的立体选择性水解和转酯反应。3 芳香化合物的生物工程技术前景欧盟目前的一个研究课题主要应用基因工程来将单萜转化为具有强烈香味活性的功能氧化产品。一个野生菌株作为宿主,向其引入一个编码单萜转化酶的基因从而使之具有特殊催化功能的基因工程菌。另一个实用的例子是利用基因修饰来去除啤酒中的双乙酰,通过添加一种携带了 -乙酰乳酸酯脱羧酶的基因工程菌,来去除双乙酰前体物的形成,这样耗时后发酸过程可不再需要。相同的单基因操作方法曾应用于一种携带丙乳酸酶的啤酒酵母,此方法可降低酒的酸性,改善挥发
12、性成份的组成。当然,目前在利用完整的代谢过程来生产芳香化合物还存在一些技术限制。实际上,每一个生物过程都是建立在:合适微生物的筛选、全套化学物理参数的调节、反应器设计和在线控制等基础上的。如果目标产物为一个挥发性香料,还存在一些其他的问题: 1.前体的筛选,添加的时间和方式。 2.原位产品的回收:产品的保护,代谢平衡的转移,反馈抑制的去除,产品的细胞毒性。 3.连续发酵:产品生成有时可能会与生长同步,然而许多挥发性代谢产物不是在稳定期积累的次级产品。尽管许多微生物发酵母过程被报道可产生有吸引力的香料化合物,但是可以工业化应用的项目非常有限。专利虽可得保护,但市场上的一个产品暂且还不能分辨出它是
13、“天然发酵香料”还是传统蒸馏或萃取所得。例如通过微生物转化-苯丙氨酸可得到300-1 苯甲醛,再通过原位回收可得到 1-1 苯甲醛。其中主要技术有: 1.通过惰性气体从生物培养基带走苯甲醛。 2.大孔离子交换树脂吸附。 3.通过全蒸发过程回收苯甲醛。虽然“天然”苯甲醛销售量要远高于植物提取所得,但还是不清楚苯甲醛的生物转化是否已达到工业规模。大量肉桂醛的逆羟醛剪切反应开辟了一个灰色“化学区”。目前,手性分析和同位素分配分析已达到较高标准,而且正被各专业实验室应用来鉴定天然苯甲醛真实性。普通消费者的消费心理,即天然化合物要比化学合成的更健康,已反映在食品法规中。这就使得天然的和化学合成的产品泾渭分明,天然香料通常拥有更高的价格,微生物香料的价格如在 200-2000 美元/公斤范围之内,则具有明显的竞争力。而生产成本的主要因素是:原材料、人力和能耗。目前影响香料化合物技术应用的推动力正逐渐增强,这其中不仅包括技术方面,而且还包括市场发展、立法、经济以及人们对化工过程环境保护意识的增强。通常产品如生物制备的得率在 1-1 以上,就将有明显的利润。
