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1、发酵工程实验发酵工程实验（适合发酵工程原理与技术）张建国 用前前 沿沿发酵工程（Fermentation Engineering）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程） 。在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应
2、器加工底物（即有生化催化剂参加） ，以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。生物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进行的实验种类不同。本实验内容根据本校的具体条件进行安排。安排的思路是以最简洁有效的方式针对发酵过程的重要要素进行实验，便于学生对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进行社会科学实践打下良好基础。第一篇第一篇 野生型菌株的筛选野生型菌株的筛选经典的发酵产物来自微生物，土壤是微生物的大本营。生产菌株的选育源头都来自于自然界。如何从自然界中筛选目的微生物
3、，可以根据目的微生物和产物的特性作为筛选条件，进行筛选提高筛选效率，从而有效的解决菌株从无到有的问题。实验二实验二 排斥美兰放线菌的筛选排斥美兰放线菌的筛选一 实 验 目 的筛选能够和美兰发生排斥反应的放线菌。二 原 理放线菌目前是合成一些抗生物质的主要微生物种群。美兰在酸性条件下带正电荷，个别放线菌在生长过程中可以释放出带正电荷的产物。两者在固体培养基中能够形成特殊的排斥圈。目前研究表明这种产物有可能是一种生物碱性物质，对其他菌体有良好的抑制和杀灭作用，可以作为药物的靶向载体和食品添加剂。放线菌一般生长条件在中性，而美兰在酸性条件下带正电荷，所以培养条件选择在中性偏酸性。在筛选过程中会有大量
4、的杂菌生长从而影响筛选效果的观察和筛选分离，为此要在培养基中加入一些对杂菌有抑制作用但对放线菌抑制作用较小的化学物质高锰酸钾。为了避免杂菌的影响要及时的观察和分离。三. 材料与仪器1. 材料葡萄糖,酵母粉， NH4SO4， K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, ZnSO4, FeSO4,2. 仪器牛皮纸、培养皿、试管、涂布棒、恒温培养箱、玻璃珠四方法与步骤1. 筛选培养基的配置1）培养基成分葡萄糖 50 gL-1,酵母粉 5 gL-1，1 NH4SO410 gL-1，0.8g K2HPO4 0.8 gL-1, KH2PO4 1.36 gL-1, MgSO4 0.05 gL-1, ZnS
5、O4 0.05 gL-1, FeSO4 0.03 gL-1,调节 pH 为6.8，1105 Pa 灭菌 30 min，酵母膏单独灭菌。2）. 高锰酸钾溶液的配置称取 7.5 g K2Cr2O7，用 100mL 去纯水溶解灭菌待用。3）. 美兰溶液配制称取 0.2g 美兰，用 100mL 去纯水溶解灭菌待用。在培养基冷却至 7080左右时，分别加入高锰酸钾溶液和美兰溶液，使培养基中的含量分别为 75mg/L 和 0.002g/L。3. 土样的采集和样品的处理 每大组取三种不同环境的土样并记录当时取样环境情况（每一小组以其中一个地方进行分离） 。 以小组为单位进行稀释分离。取土样 1 克，加入 9
6、mL 无菌水，逐步稀释至 10-1、10-2、10-3。 （每个梯度涂 2个瓶皿） 。4. 培养（1） 30恒温培养 120 小时（2） 三天后开始间隔 24 小时观察，生长和形成透明圈情况五记录与结果1.环境情况地点一：地点二：地点三：2. 绘制出透明圈数据共享地点一 地点二 地点三放线菌生长情况形成透明圈情况六结果分析从不同地点获得的结果进行分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。七 作业1. 为什么要用加入重铬酸钾和美兰？2. 在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果.3. 为什么同样一个同样要稀释几个不同梯度进行涂平板.第二篇第二篇 菌种选育菌种选育微生物菌
7、种的选育目的防止菌种退化解决生产实际问题，提高生产能力，提高产品质量，开发新产品。目前菌种选育的方法主要有自然选育、诱变育种、杂交育种、分子育种等手段。但是诱变育种还是育种的主流，诱变育种根据诱变剂的种类可分为化学诱变和物理诱变。本实验以紫外线作为物理剂进行诱变。诱变过程一般包括诱变出发菌株的选择、诱变剂量的选择和诱变及其筛选。第三篇第三篇 培养条件优化培养条件优化1 试验设计在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。1.1 单因素法（ One at a time）单因素方法
8、的基本原理是保持培养基中其他所有组分的浓度不变，每次只研究一个组分的不同水平对发酵性能的影响。这种策略的优点是简单、容易，结果很明了，培养基组分的个体效应从图表上很明显地看出来，而不需要统计分析。这种策略的主要缺点是：忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。但由于它的容易和方便，单因素方法一直以来都是培养基组分优化的最流行的选择之一。1.2 正交实验设计（ Orthogonal design）正交设计就是从 “均匀分散、整齐可比 ”的角度出发，是以拉丁方理论和群论为基础，用正交表来安排少量的试验，从多个
9、因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它们对实验的影响规律，从而找出较优的工艺条件。石炳兴等利用正交实验设计优化了新型抗生素 AGPM 的发酵培养基，结果在优化后的培养基上单位发酵液的活性比初始培养基提高了18.9 倍。正交实验不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。而且对于多因素多水平试验，仍需要做大量的试验，实施起来比较困难。1.3 均匀设计 (Uniform design)均匀设计是我国数学家方开泰等独创的将数论与多元统计相结合而建立起来的一种试验方法。这一成果已在我国许多行业中取得了重大成果
10、。均匀设计最适合于多因素多水平试验，可使试验处理数目减小到最小程度，仅等于因素水平个数。虽然均匀设计节省了大量的试验处理，但仍能反映事物变化的主要规律。1.4 全因子实验设计 (Full factorial design)在全因子设计中各因素的不同水平间的各种组合都将被实验。全因子的全面性导致需要大量的试验次数。一般利用全因子设计对培养基进行优化实验都为两水平，是能反映因素间交互作用（排斥或协同效应）的最小设计。全因子试验次数的简单算法为（以两因素为例）：两因素设计表示为 a b，第一个因素研究为 a 个水平，第二个因素为 b 个水平。Thiel 等试验了两个因素： 7 个菌株在 8 种培养基
11、上，利用 7 8（56 个不同重复）。 Prapulla 等试验了三个因素：碳源（糖蜜4%，6%，8%，10%，12%），氮源（ NH4NO3 0g/L、0.13g/L、0.26g/L、0.39g/L、0.52g/L、）和接种量（ 10%、20%），利用5 5 2 设计（50 个不同重复）。1.5 部分因子设计 (fractional factorial design)当全因子设计所需试验次数实际不可行时部分重复因子设计是一个很好的选择。在培养基优化中经常利用二水平部分因子设计，但也有特殊情况，如Silveira 等试验了 11 种培养基成分，每成分三水平，仅做了27 组实验，只是 311 全
12、因子设计 177147 组当中的很小一部分。两水平部分因子设计表示为：2nk，n 是因子数目，1/2k 是实施全因子设计的分数。这些符号告诉你需要多少次试验。虽然通常部分因子设计没有提供因素的交互作用，但它的效果比单因素试验更好。1.6 Plackett-Burman 设计（Plackett-Burman design）由 Plackett 和 Burman 提出，这类设计是两水平部分因子试验，适用于从众多的考察因素中快速、有效的筛选出最为重要的几个因素，供进一步详细研究用。理论上讲 PB 试验应该应用在因子存在累加效应，没有交互作用 因子的效应可以被其他因子所提高或削弱的试验上。实际上，倘若
13、因子水平选择恰当，设计可以得到有用的结果。 Castro 等利用 PB 试验对培养基中的 20 种组分仅进行了 24 次试验，使 -干扰素的产量提高了近 45%。1.7 中心组合设计（ Central composite design）中心组合设计有 Box 和 Wilson 提出，是响应曲面中最常用的二阶设计，它由三部分组成：立方体点、中心点和星点。它可以被看成是五水平部分因子试验，中心组合设计的试验次数随着因子数的增加而呈指数增加。1.8 B Bo ox x B Be eh hn nk ke en n 设计(B Bo ox x B Be eh hn nk ke en n design)由
14、Box 和 Behnken 提出。当因素较多时，作为三水平部分因子设计的B Bo ox x B Be eh hn nk ke en n 设计是相对于中心组合设计的较优选择。和中心组合设计一样，B Bo ox x B Be eh hn nk ke en n 设计也是二水平因子设计产生的。2 最优化 how(event)“ class=“t_tag“技术（实验统计）目前，对培养基优化实验进行数学统计的方法很多，下面介绍几种目前应用较多的优化方法 2.1 响应曲面分析法Box 和 Wilson 提出了利用因子设计来优化微生物产物生产过程的全面方法，Box-Wilson 方法即现在的响应曲面法（ (R
15、esponse Surface Methodolog，简称RSM）。RSM 是一种有效的统计技术，它是利用实验数据，通过建立数学模型来解决受多种因素影响的最优组合问题。通过对RSM 的研究表明，研究工作者和产品生产者可以在更广泛的范围内考虑因素的组合，以及对响应值的预测，而均比一次次的单因素分析方法更有效。现在利用SAS 软件可以很轻松地进行响应面分析。2.2 改进单纯形优化法 (Modified simplex method)单纯形优化法是近年来应用较多的一种多因素优化方法。它是一种动态调优的方法，不受因素数的限制。由于单纯形法必须要先确定考察的因素，而且要等一个配方实验完后才能根据计算的结
16、果进行下一次实验，因此主要适用于实验周期较短的细菌或重组工程发酵培养基的优化，以及不能大量实施的发酵罐培养条件的优化。2.3 遗传算法(Genetic algorithm，GA)该法是一种基于自然群体遗传演化机制的高效探索算法，它是美国学者Holland 于 1975 年首先提出来的。它摒弃了传统的搜索方式，模拟自然界生物进化过程，采用人工进化的方式对目标空间进行随机化搜索。它将问题域中的可能解看作是群体的一个个体或染色体，并将每一个体编码成符号串形式，模拟达尔文的遗传选择和自然淘汰的生物进化过程，对群体反复进行基于遗传学的操作(遗传，交叉和变异)，根据预定的目标适应度函数对每个个体进行评价，依据适者生存，优胜劣汰的进化规则，不断得到更优的群体，同时以全局并行搜索方式来搜索优化群体中的最优个体，求得满足要求的最优解。（1）正交设计法（4 学时）目的要求目的要求掌握发酵工艺条件或参数的多因素实验设计和操作方法。实验原理实验原理发酵过程涉及到数个工艺参数，每个参数有多个水平，每个因素之间还
