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1、苏州大学硕士学位论文IL-18抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究姓名：叶文峰申请学位级别：硕士专业：传染病学指导教师：吴建成20090501I L 1 8 抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究中文摘要I L 一1 8 抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究中文摘要中又捅要目的：探讨白细胞介素1 8 治疗裸鼠肝癌皮下移植瘤的疗效、剂量及可能的机制；方法：以H e p G 2 细胞在裸鼠皮下接种，形成人肝癌皮下移植瘤后，荷瘤裸鼠分别以不同剂量进行区组，以腹腔内注射白细胞介素1 8 进行治疗，观察肿瘤的生长速度和瘤体大小的变化，4 周后处死裸鼠，留取瘤体、肝脏标本，切片H E 及免疫组化染色检测肿瘤细胞坏死情况及C
2、a s p a s e 3 的表达情况，R T - P C R 检测肿瘤细胞的C a s p a s e 3 表达情况：结果：1 以5 1 0 6 的H e p G 2 细胞接种于裸鼠皮下可以成功地建立皮下移植瘤模型，成瘤率1 0 0 ；2 腹腔内注射I L 1 8 对肝癌皮下移植瘤的生长有显著的抑制作用，肿瘤重量、体积、相对体积等指标均低于对照组，具有统计学意义( 尸 9 5 ；用l m l 一次性医用注射器抽吸细胞悬液1 0 0 山( 实有H e pG 2 细胞数5 0 x 1 0 6 ) ，全部推注入裸鼠右前肢皮下，每只均仅接种此l 点。三、I L 1 8 治疗裸鼠皮下转移性肝癌将上述接
3、种H e p G 2 细胞裸鼠随机分为A 、B 、C 、D 四个组，接种肿瘤细胞同时，4I L 1 8 抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究第一部分实验材料与步骤使用不同剂量I L 1 8 腹腔注射，进行治疗。对照组使用注射用水与治疗组相同部位相同时间腹腔注射，隔日注射一次，观察4 周颈椎脱位法处死动物，留取肿瘤和肝脏组织进行后期实验室检测。四、常规H E 染色将福尔马林中保存的瘤体和肝脏进行H E 染色。1 取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4 岬切片。2 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗3 苏木素染色5 m i n ，自来水冲洗。4 盐酸乙醇分化3 0 s 。5 自来水浸泡1 5 m i
4、 n 。6 置伊红液2 m i n 。7 常规脱水，透明，封片8 请病理科两位专业医师双盲阅片，做出病理诊断。五、免疫组织化学染色检测( S P 法，D A B 显色)检测C a s p a s e 3 采用P B S 代替一抗设置阴性对照，使用阳性对照切片作为阳性对照。1 、脱蜡、水化1 ) 6 0 x 2 0m i n - - - X y l e n e2x l Om i n u t e s ；2 ) 1 0 0 a b s o l u t ee t h a n o l ：2x 5m i n u t e s ；3 ) 9 5 e t h a n o l2m i n u t e s ；4 )
5、 8 0 e t h a n o l2m i n u t e s ；5 ) 7 0 e t h a n o l2m i n u t e s ；6 ) d i s t i l l e dw a t e r ：5r a i n ；I L 1 8 抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究第一部分实验材料与步骤7 ) P B S 洗3 次x 3m i n 。2 、抗原修复暴露抗原决定族8 ) e y j 3 牛放Z 0 0 1M 柠檬酸钠缓冲溶液( p H 6 0 ) 后，在微波炉里高火4m i n 至沸腾后，再加热约6m i n x 4 次，每次间隔补足液体，防止干片。3 、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶9
6、) 用封闭通透液浸润切片3 0m i n ( 避光) 。4 、封闭非特异性蛋白1 0 ) P B S 溶液洗3 次x 3m i n ；1 1 ) 将切片取出，周围水分用滤纸吸干，组织滴入羊血清( 与二抗来源一致) 后放入湿盒中，室温3 0 ( 1 0 - - - - 3 0 ) m i n ；5 、一抗孵育1 2 ) 甩去切片上的羊血清，用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入己稀释的一抗( 1 ：2 0 0 ) 后，放入湿盒中室温1 小时，然后4 度过夜，从冰箱中取出需3 7复温4 5m i n 。6 、二抗孵育1 3 ) 将一抗倒掉并用P B S 洗5m i n x 5 次；1 4 ) 用滤纸
7、将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入3 7 恒温烤箱中3 0m i n 。1 5 ) 用P B S 洗5 次x 5m i n ；7 、S P 反应1 6 ) 加入S P 后放入3 7 度烤箱中3 0 m i n 。1 7 ) 用P B S 洗5 次x 5m i n ：8 、显色1 8 ) 加入D A B ( 快速滴入，观察染色情况，倒掉染液) ，显色时间控制在约5m i n( 3 “ - 1 0m i n ) ，由镜下观察颜色控制时间。9 、复染、脱水、透明、封片6I L 1 8 抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究第一部分实验材料与步骤1 9 ) 用P B S3 次x 3 m i n 后，用
8、双蒸水洗5m i n ；2 0 ) 加一大滴苏木素染液，胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染2 0S 后自来水冲洗，双蒸水洗5m i n ，再用P B S 返蓝5m i n 。2 1 ) 脱水：5 0 e t h a n o l1 - 2m i n ，7 0 e t h a n o l1 2m i n9 5 e t h a n o l1 - 2m i n ；9 5 e t h a n o l1 - 2m i n ；1 0 0 a b s o l u t ee t h a n o l ：( 1 2 ) m i n ；2 2 ) 透明：X y l e n el ( 1 - 2 ) m i n - -
9、, X y l e n e2 ( 1 2 ) m i n2 3 ) 封片：中性树胶2 4 ) 镜检，获取图象。六、R T P C R 检i 贝J J C a s e p a s e 3 、I L 1 8 B Pm R N A 水平的表达1 、引物C a s e p a s e - 3 引物序列：上游引物5 G G G c T G C T G C A A T G A C G A - 3 ，下游引物5 G G G A A C G C T C C A G G A C l m 心3 ，扩增片段长度2 4 7b p 。h l L 1 8 B P 引物序列：上游引物5A A A C T C C A T T
10、 C C C A C C T A C 3 ，下游引物5 一A G A G G C A G C A T T T C A A C C 3 ，扩增片段长度3 2 2b p ；r o l L 1 8 B P 引物序列：上游引物5 G G G A C G G A G C T G T C T T C A 3 ，下游引物5 T A C T G G C T G G GC A A T G G T - 3 ，扩增片段长度2 3 8b p 。内参照( p - a c t i n ) 引物序列：上游引物5 -A C A C T G T G C C C A T C T A C G A G G G G3 ，下游引物5 一
11、A T G A T G G A GT T G A A G G T A G T T T C G T G G 3 ，扩增片段长度3 6 6b p ；2 RT - P C R 步骤( 1 ) 实验所用物品的去R N A s e 处理a 所有玻璃器皿均于使用前1 8 0 干烤3 小时以上；b 塑料器皿用0 I D E P C 水冲洗浸泡，3 7 放置2 小时，控干液体，高压除去D E P C ( 2 ) 提取组织总R N Aa 取冻存肿瘤及正常组织1 0 0 m g ，加入I m lT r i z o l ，4 “ C 充分溶解后匀浆；b 加0 2 ml 氯仿，强烈振荡1 5 秒，使其充分混匀，静止2
12、 - 3 m i n ，4 “ C 、1 2 0 0 0 9 离心1 5 m i n ；7I L 1 8 抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究第一部分实验材料与步骤c 取上清至1 5 m lE P 管中加入0 5 m l 异丙醇并混匀，沉淀1 0 m i n , 4 “ C 、1 2 0 0 0 9 离心l O m i n ；d 弃上清，加入7 5 乙醇6 0 0 p 1 混匀，4 “ C 、1 2 0 0 0 9 离心5 m i r ae 弃上清，加入无水乙醇8 0 0 p 1 混匀，4 、1 2 0 0 0 9 离心5 m i n ；f 弃去上清，空气干燥，加无R N A s e 的水溶解R N
13、 A ；( 3 ) R N A 的鉴定和定量完整性鉴定：将R N A 与样品缓冲液以1 ：4 混合，在2 琼脂糖凝胶( 含0 5 9 9 m l 溴化乙锭) 中电泳，恒压3 - 5 V c m ( 8 0 r ) ，电泳缓冲液为1x TB E ，待样品缓冲液中的溴酚蓝迁移约3 c m 停止电泳，将凝胶移至紫外投射仪下进行成像观察。纯度鉴定：取R N A 用蒸馏水稀释1 0 0 0 倍，在紫外分光光度计上测2 6 0 n m 和2 8 0 n m两个波长的吸光度( O D 2 6 0 和O D 2 8 0 ) 。定量：利用O D 2 6 0 值按如下公式计算R N A 含量：R N A 含量(
14、1 上g m 1 ) = O D 2 6 0 n m x 4 0 x 稀释倍数。将R N A 浓度调整至0 5p “l 。( 4 ) R T P C R 扩增目的D N A 片段：a 按照说明书，应用试剂盒中阳性对照R N A 和对照引物进行预实验，以确定试剂功能完好。b 逆转录反应：于经D E P C 处理过的O 5m lE p p e n d o r f 管中加入D E P C 水9 “l 、R N A41 t l 、随机六聚寡核苷酸引物2 “1 ，7 0 。C 变性1 0 分钟，然后加入逆转录缓冲液8p l ，l O m m o l Ld N T P1 2 5 肛l ，R N A s i
15、 n0 5l x l ，逆转录酶M M L V4 1 d ，加水至反应体系4 0 l - t l ，3 7 “ C 培养6 0分钟9 5 延伸5 分钟将总R N A 逆转为c D N A ；表1P C R 反应体系( 5 0 l x l )试剂量( r t l )1 0 x B u f f e rM 9 2 + d N T P正义引物 反义引物 T a g 酶 模板c D N AH ，O5411lO 333 4 79 4 变性5 分钟 8 9 4 变| | 生3 0 秒5 8 退火3 0 秒卜3 5 个循环7 2 延伸6 0 秒 O 7 2 延伸7 分钟图1P C R 循环条件I L 1 8
16、抗裸鼠移植性肝细胞癌机制的研究第一部分实验材料与步骤( 5 ) P C R 目的基因扩增：反应体系( 见表1 ) 和循环条件( 见图1 ) ：如表3 加好P C R 反应体系，混匀离心后，V E G F 按图2 反应循环条件，I L 一1 8 B P的退火温度为5 6 ，循环为3 2 个，其余反应条件相同；于P C R 仪进行基因扩增；内参照扩增按相同反应条件同时进行。( 6 ) R T P C R 产物的鉴定和分析：分别取1O 肛lP C R 反应产物进行2 琼脂糖凝胶电泳02 0 v 电压) ，紫外灯下观察电泳带，凝胶成像分析系统扫描拍照。将凝胶电泳图像输入美国A l p h a 9 9 0 0 凝胶分析系统，应用D I m a g eA n a l y s i sS o f t w a r e 进行表达强度分析。9I L -
