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1、吉林畜牧兽医增刊专题综述牛传染性鼻气管炎( I B R ) 诊断方法研究进展孟日增，石建平，肖成蕊，王伟利，王振国( 吉林出入境检验检疫局，吉林长春1 3 0 0 6 2 )牛传染性鼻气管炎( I n f e c t i o u sB o v i n eR h i n o t r a c h e i t i s I B R ) 是由牛疱疹病毒I 型( B H V I ) 引起的一种病毒性传染病。B H V I 属疱疹病毒科目前已知的有3 个亚型：B H V l 型、B H V 2 a 、B H V 2 b 型但只有一个血清型【1 1 。该病最初在欧洲发生2 0 世纪3 0 年代随着牛的输出而传
2、到美国M i l l e ( 1 9 5 5 ) 在美国首次报道该病的发生M a d i n 等( 1 9 5 6 ) 分离到病毒1 9 6 4 年H u c k 确认了本病毒属于疱疹病毒。目前该病呈世界性分布对肥育率、产奶量和繁殖影响极大是引起养牛业重大经济损失的疾病之一。我国于1 9 8 0 年在进E l 新西兰奶牛中首次报道该病【4 】其后各地有零星发病报道在进E l 牛只检疫中厦门出入境检疫局孔繁德等( 2 0 0 6 ) 检测30 0 0 多只澳洲进口种牛其中l2 9 3 头血清样品呈现I B R 抗体阳性。并有5 头分离到病毒。因而有必要建立并应用有效检测手段来加强检疫以防止病源的
3、进入国内对已感染I B R V 的牛场采取严格的控制措施隔离淘汰抗体阳性牛逐步净化养牛场最后达到消灭并根除本病的目的1 3 , s 6 3 1 病原学诊断1 1 病原分离鉴定1 1 1 样品采集方法对早期感染出现症状牛只主要采集有呼吸道症状和有外阴道炎( 或龟头炎) 病例的棉拭子其中鼻腔棉拭子要求无菌采取置于含5 1 0 倍常规用量的抗生素的细胞培养液中采取生殖道拭子首先要用洗必泰清洗外阴部然后将拭子在生殖道阴道粘膜表面上转取粘液龟头可用缓冲液冲洗包皮收集其洗液最后将样品置于含5 l O 倍常规用量的抗生素的细胞培养液中冷藏保存并迅速送达实验室。在实验室将拭子在培养基中充分搅动以便将病毒洗脱取
4、出拭子后30 0 0r r a i n 离心1 0m i n ，取上清液即为病毒分离的样品病理解剖学检查的同时可收集呼吸道粘膜、扁桃体、肺和支气管淋巴结、组织作病毒分离的病料，对于流产病例，可收集胎儿的肝、肺、脾、肾和胎盘子叶，冷冻保存，迅速送检。 也可采集精液用于病毒分离由于精液中含有对细胞有毒性或对病毒增殖有抑制作用的酶和其他因子通常加含有抗生素的犊牛血清( 无I B R 抗体) 作l O 倍稀释作两次细胞传代培养。1 1 2 病毒分离试验可用于I B R V 分离的细胞包括原代( 或次代) 牛肾、肺或睾丸细胞也可用胎牛肺、鼻甲或气管等 组织制备的细胞株及已建立的传代细胞系。目前各实验室使
5、用较多的是牛肾传代细胞( M a r d i nD a r b yB o v i n eK i d n e y ，M D B K ) 和牛气管细胞( B o v i n eT r a c h e a lC e l l ，B T C ) 。有人报道该病毒也能在山羊、绵羊、兔和马的肾细胞及兔睾丸、人羊膜等细胞培养物内增殖。使用9 6 孔细胞培养板时每孔需接种制备好的上清夜1 0 0 2 0 0i L L 于3 7 吸附lh 后倾去液体 加入维持液1 0 0 扯。每天观察细胞病变情况一般于接种后3d 出现C P E 若7d 还不出现C P E 应再盲传1 次，将培养物经3 次冻融后离心取其上清液接种
6、于新的良好单层细胞的细胞培养板做进一步病毒分离。 1 1 3 病毒鉴定为鉴定致细胞病变的病毒是否为I B R V 细胞培养的上清液必须与单特异I B R V 抗血清或单克隆抗2 3 3 专题综述吉林畜牧兽医增刊体( M c A b ) 作中和试验。可采用标记的单特异性抗血清或单克隆抗体的进行免疫荧光或免疫过氧化物酶试验直接测定I B R V 抗原。1 2 病毒的抗原检测l - 2 1 直骧免疫荧光试验鼻、眼或生殖道拭子可直接涂抹于盖玻片或者离心后将细胞沉积物点于载玻片上进行免疫荧光测定( S c h i p p e rI A 等，1 9 6 8 ) 。病理解剐收集的组织可进行冰冻切片，然后进行
7、直接免疫荧光测定。该方法较为快速。但是敏感性要低一些。另外容易出现菲特异性反应。 1 2 2 抗原捕获E L I S AC o l l i n sJK 等( 1 9 8 8 ) 建立的抗原捕获E L I S A 可检出抗原量达1 0 4 1 0 5 T C I D 5 0 ，可到得较高的阳性检出率。1 3 核酸检测1 3 1 聚合酶链式反应( P C R ) V a nd e rE n g e l e n b u r g ( 1 9 9 4 ) W i e d m a n n 等( 1 9 9 3 ) 和V i l c e k ( 1 9 9 4 ) 首次报道将聚合酶链式反应( P C R )
8、 方法用于I B R 的诊断。常用于P C R 扩增的目的片断有T K ，g B ，g c 和g D 等基因。F r e d e r i c k( 1 9 9 5 ) 以j I B R VT K 基因为模板对4 株野毒株扩增出1 8 3 b p 的特异片段：K i b e n g e ( 1 9 9 4 ) 和Y 删 ( 1 9 9 5 ) 也以T K 基因区为目的片段建立了P C R 检测方法。M a r s r i ( 1 9 9 6 ) 建立了检测精液中病毒班基因的套式P C R 方法，G a l e o t a 等( 1 9 9 7 、建立了鉴别诊断T K ，g C 基因缺失疫苗的定量
9、P C R 方法。国内张桂红等f1 9 9 8 ) 以发表的g B 基因和T K 基因为模板设计了两对引物，分别对7 株I B R V 进行扩增，均得到3 3 9 b p 和4 5 7 b p 的特异性片段证明此法特异性强、快速准确。陈茹等( 2 0 0 5 ) 建立了针对g C 基因的实时荧光P C R 诊断技术该方法能特异检测I B R 病毒检测时间短，敏感性比常规P C R 高1 0 3 1 0 4 倍适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中牛传染性鼻气管炎感染的快速病原检测。P C R 比病毒分离更加敏感可检出3 个分子的病毒。由于其具有灵敏度高能够检测牛血清或组织样品中微量的I B R
10、V 等优点。因此得到较为广泛的应用2 - “ 。 1 3 ，2 孩酸探针杂交S o u t h e r nB l o t 杂交试验是一种比较敏感的检测I B R VD N A 的方法已得到国际认可。此法检测的阳性结果可以宜接确定为I B R V 的携带者要比传统的血清学方法更为敏感、特异。P a n d i t a ( 1 9 9 5 ) 和X i a 等f 1 9 9 5 ) 报道了用斑点杂交法检测I B R V 。吴时友等( 1 9 9 8 ) 报道认为该方法可检出l O p g 的 I B R VD N A 能明显区分I B R V 感染细胞和未感染的正常细胞具有很高的灵敏度和特异性。用
11、生物素代替3 2 P 制备的改良型探针也取得了相同的结果还可应用于检测牛精液中I B R VD N A 。由于此探针可在一2 0 保存一年以上有利于推广使用又可弥补放射性同位素探针半衰期短及对人体健康有害的弊端。2 血清学诊断I B R V 感染后常呈隐性感染血清学检查是鉴定动物的感染状态非常实用且十分有价值的方法。除初乳中获得母源抗体的犊牛和经灭活疫苗免疫的非感染牛外抗体阳性动物可认为是病毒携带者和潜在的间歇性排毒者，是重要的传染源。通过皿清学诊断可诊断急性感染，依此制定合理的防控措施，国际贸易中常常使用此方法从阴性结果中筛选合格的进出境牛只。广泛性血清流行病学调查可作为根除计划的实施和后续
12、跟踪的技术支撑。2 1病毒中和试验( 国际贸易指定实验l病毒中和试验被0 1 E 指定为国际贸易试验方法之一该方法是测定免疫血清是否具有中和病毒的2 弘，吉林畜牧兽医增刊专题综述能力。以病毒经不同稀释度的免疫血清中和后对细胞的感染力强弱为特征得出该待检血清的中和效价。该方法被认为是血清抗体检测最经典、最标准的方法。通常的做法是固定病毒稀释血清法用1 0 0 T C I D 如测定倍比稀释的血清中和指数注意血清( 阳性血清、阴性血清、待检血清) 均须5 6 3 0r a i n 灭活用于国际贸易检疫时病料血清孵育时间采用2 4h 由于I B R V 只有1 个血清型只要有1个已知标准毒株的免疫血
13、清通过在敏感细胞培养后所进行的中和试验就可以作出确诊。但该方法存在费时费力、检测周期长、易受不确定因素影响如病毒毒价的准确性、细胞的种类、数量及其生长情况、病毒血清孵育时间长短不同等因素的影响另外对操作人员的专业素质和操作熟练程度要求较高。2 2 酶联免疫吸附试验fE L I S A lf 国际贸易指定实验)E H S A 方法因其具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点在大批量动物进口时作为首选方法被 推广使用主要包括间接E H S A 和阻断E L I S A 。K r a m p s 于1 9 9 4 年报道了E L I S A 是检测I B R V 抗体的敏感、特异的检测方法。A c h
14、 i l l e s 在1 9 9 0 年建立了双抗夹心E L I S A 法检测I B R 并得到初步应用。国内曲新勇等( 1 9 9 8 ) 用耗牛I B R V 8 5 一Y 株按C h o 等方法制备的抗原。建立了E L I S A 诊断方法，应用其检测血清抗体结果表明其抗原性好特异性强操作简单、快速适用于一般实验室并与中和试验作了敏感性比较验证了可以用于其它牛群的I B R V 抗体的检测。F l o r e n t 等( 殷震等1 9 9 8 ) 研究了应用I B R VI g M 抗体捕获E L I S A 法进行I B R V 的早期感染检测以针对牛l g M 的第一单克隆抗体
15、作为捕获抗体而第二单克隆抗体用来测定特异性抗病毒抗体。经试验感染和自然感染动物的血清样品检测表明在临床症状出现后5 1 0 d 的血清样品即可诊断出I B R V 感染。同间接E L I S A 相比较阻断E L I S A 敏感性更高有人制备两种针对g E 单克隆抗体用于检测疫苗接种牛和自然感染牛( P e r t i n 1 9 9 3 ：o v a nO i r s c h o t 1 9 9 7 ：W e l l e n b e r g 1 9 9 8 ) 。国内王海燕等( 2 0 0 5 ) 建立g E 重组蛋白间接E L I S A 诊断方法检测牛血清特异性g E 抗体在对4 0
16、3 份血清样品检测中与进口试剂盒的符合率为9 4 3 与中和试验的符合率为8 5 ，7 。吴春涛( 2 0 0 6 ) 利用融合蛋白原核表达策略实现了B H V 1 的g B 基因在大肠埃希氏菌中的分段高效表达并对表达的融合蛋白进行了初步纯化和抗原性分析。经W e s t e r n b l o t t i n g 和E L I S A 分析结果表明这些融合蛋白均与B H V - l 标准阳性血清反应可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎E L I S A 检测方法的建立c 埔j 。尽管E L I S A 因其快速、准确、方便而成为目前检测I B R V 的主要可选方法之一而且市场上已有多种商品化E L I S A 试剂盒还可适用于检测牛奶中的g E 糖蛋白抗体但是由于E L I S A 标准程序尚未建
