毛细管胶束电动色谱分离原理

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1、毛细管胶束电动色谱分离原理 概述 在电泳缓冲液中加入离子表面活性剂，当溶液中表面活性剂浓度超过 临界胶束 浓度时，表面活性剂的单体就结合在一起，形成一个球体，称为胶 束。胶束一般是由 10-50 个碳原子单位的长链分子组成，具有头部( 或 外层) 亲水、尾部 ( 或内层 )疏水的特性。在溶液中，头部露在外面，尾 部包在胶束中。这种胶束的形成是疏水效应的结果，能使系统的自由 能减少。胶束可分为正相胶束和反相胶束两类，以前者应用较多。反 相胶束则是指在有机溶剂中形成的胶束，尚未作系统研究。 用来作为表面活性剂的化合物很多，大体有四类: 阴离子、阳离子、两 性离子和 非离子表面活性剂，其典型化合物及

2、主要性质如表4.1 所示。应用最多的是前两类，且尤以十二烷基硫酸钠(SDS)等使用最为普遍。 图4.1是SDS 胶束的结构示意， 里面有一个疏水内核，外面布满了.S03离子。在MECC 系统中，实际上存在着类似于色谱的两相，一是流动的水相， 另一是起到固定相作用的胶束相，溶质在这两相之间分配，由其在胶 束中不同的保留能力而产生不同的保留值。与毛细管区带电泳一样， 由于缓冲液在靠近管壁处形成的正电，使其显示出强烈的电渗流而向 阴极移动。对于 SDS 胶束来说，由于其外壳带很大的负电荷，本应以较 大的淌度朝阳极迁移，但由于在一般情况下电渗流的速度大于胶束的 迁移速度，这就迫使胶束最终以较低的速度向

3、阴极移动，如图4.2 所 示。由此可见，毛细管胶束电动色谱有别于普通色谱的一个重要特性 为它的“固定相”是移动的，这种移动的“固定相”又被称之为“准 固定相。在毛细管胶束电动色谱中，中性粒子由于本身疏水性的不同而得以分 离. 具有不同疏水性的粒子与胶束的相互作用不同，疏水性强的作用力就大，其留在胶束相中的时间就长。由于胶束相的绝对速度很小，组 分的保留时间就长; 反之组分较多地停留在缓冲液中按电渗的速度移 动，保留时间就较短。以上所述为使用阴离子表面活性剂的情况，如 果使用阳离子表面活性别，则清况相反。 机理 前己述及 MECC 中存在有两相，一相是以胶束形式存在的准固定相，另 一相是作为载体

4、的液相，又称流动相。试样中的组分在MECC 中的分 离，从本质上来说，是由它们的分子和胶束相及流动相分子之间的相 互作用的差异造成的，尽管对不同的胶束相互作用的形式不同，但是 它们所反映的问题本质是一样的。具体来说，溶质在毛细管柱内受到 两种力，一是胶束对它的作用力，二是流动相的溶解力，即溶质处于 两个作用力场的平衡之中，作用力强，溶解力差时，溶质有较大的保 留; 反之，则较早流出毛细管柱，见图4.3. 也就是说，不同组分分子和胶束相与流动相分子相互作用的不同，最 终将导致它们在两相中的浓度比不同，或者说分配系数不同。设X物质 因相互作用较大，而在胶束相中的浓度较大，Y物质因相互作用较小而 浓

5、度较小，则 X的分配系数大于 Y的分配系数（分配系数K=溶质在胶束 相的浓度 / 溶质在流动相的浓度），在这一MECC系统中， X在Y的后面流 出。 综上所述，不同组分在毛细管胶束电动色谱中的分离，从根本上来说 是由于它们的分子与胶束和流动相分子相互作用的差异造成的，而这 种相互作用的差异通过分配系数的差异来反映，分配系数和上述一系 列微观参量都有明确的定量关系。问题的另一方面是，既然分配系数 及其差异是引起组分在MECC 中分离的根本原因，那么，必然地也会同 MECC中可测宏观参量之间存在着某种定量关系，事实上，MECC中通常 采用容量因子 K的概念来间接地描绘分配系数。 容量因子的定义为

6、:k= 组分在胶束相中的量 / 组分在流动相中的量序言高效毛细管电泳 (High Performance Capillary Electrophoresis，简 称 HPCE )是 70-80 年代迅速发展起来的一类新型的电泳和色谱相结合 的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用 范围广等特点，已成为90 年代重要的高效分离手段，在生物、化学、 医药、环保、食品等领域等领域有很好的应用前景。毛细管电泳和高 效液相色谱 (HPLC)都是液相分离技术，由于它们遵循不同的分离机 理，除了具有自己的特点外两者在很大程度上可以互为补充。但是无 论从效率、速度、样品用量和成本来说，毛细

7、管电泳都显示了一定的 优势。与 HPLC相比，毛细管电泳的柱效更高一些，速度更快一些；同 时它的用量仅为HPLC的千分之一，且溶剂消耗量极小，又没有泵输运 系统，因此成本相对较低。毛细管电泳具备许多分离模式，通过改变 其缓冲液成分、添加剂和柱型，毛细管电泳有很大的选择性，可以根 据不同的分子性质( 诸如大小、电荷数、手性、疏水性等) 对极广泛的 对象进行有效的分离。相比之下，为达到类似的目的，HPLC要消耗许 多价格昂贵的柱子和溶剂，而且现在常用的HPLC方法存在分析时间 长，分离效率低及柱子易污染等缺点，因此毛细管电泳方法在这个领 域的应用越来越受到人们的关注。 毛细管电泳的结构很简单：通常

8、包括一个高压源，一根毛细管，一个 检测器以及两个供毛细管两端插入且又可和电源两端相连的缓冲液贮 槽 ， 输 出 信 号 和 记 录 装 置 。 装 置 的 示 意 图 如 下 所 示 ：毛细管电泳示意图毛细管电泳的原理也并不复杂，其原理如下所述： 1. 概述 分离原理：高效毛细管电泳(HPCE) 是溶液状态的混合物以相对较窄的 区带引入到毛细管中并在电场作用下迁移。由于混合物中各物质所带 的电荷和大小不同而具有不同的电泳淌度，因此迁移速度存在差异而 实现分离。 定量原理：根据朗伯 -比尔定律定量。2. 理论2.1 电泳淌度 当一带电离子在电场E中时，它受到电场力Fe的作用，其大小等于带 电粒子

9、的净电荷q与电场强度E的乘积，即 Fe=q*E 一旦带电粒子开始运动，除电场力外，它还受到一个与运动方向相反 的阻力作用。阻力Fd的大小与其迁移速度 (v)成正比，即 Fd=f*v 其中f为平动摩檫或阻力系数。当电场力完全被阻力平衡后，粒子以 稳态速度迁移，该稳态速度Vss与阻力系数的关系为： Vss=qE/f 若将带电粒子的电泳淌度定义为单位电场强度下的稳态速度 =q/f 很明显，粒子的大小和电荷差异都可以引起电泳淌度的差异。 2.2 电渗流 在毛细管电泳中，由于所用的毛细管多由熔融石英做成，它表面含有 硅醇基团 (SiOH)，电解质存在时这些硅醇基团可以离子化。此时，熔 融石英毛细管壁和缓

10、冲液间的界面由三层组成：带负电的石英表面 (PH2)，不可移动层和阳离子扩散层。这三层与石英表面相连，趋向 阴极移动。这种阳离子的迁移导致了整个毛细管内流体向阴极迁移， 这种液体在毛细管中的流动称作电渗流。电渗流的速度与电场强度成 正比，故电渗流淌度定义为单位电场强度下得电渗流速度： eo=Veo/E 2.3 检测方法：用于毛细管电泳的检测方法有UV-Vis 吸收法、激光光 热法、荧光法、间接测定法、电导法、安培法、质谱法、放射法、拉 曼光谱法、折射指数法等多种。也有用CITP/CZE、HPCE/HPLC 联用方 法进行检测。但是HPCE进样量小、分离速度快的特点要求检测器具有 灵敏度高、空间

11、分辨率高、响应快及在线检测功能。目前已经商品化 的检测器中，光学检测器（紫外、二极管阵列、荧光）较为成熟，电 化学检测器及放射性同位素检测器已开始应用。质谱联用因灵敏度高 也得到发展。利用HPCE时应根据所分析物质的特点选用相应的检测方 法，以 扬长避短。本实验选用的检测方法为紫外检测法。 十九世纪初，法国人Derosne, Pelletier和德国人 Sertuner 159等 相继从植物和药材中分离出生物碱，并证明它们具有明显的生理作 用，推动了植物药材有效成分的研究。目前，应着重如下研究: 研究中草药的种类和资源，寻找新药源; 研究中草药的鉴别和化学成分，以鉴 定中草药的真伪优劣，保证中

12、药质量; 研究药用动植物的遗传因素、生 长发育、环境条件与有效成分积累的关系，以及中药在采收、加工、 炮制、储藏合理的加工、炮制和贮藏，从而提高药材的产量和质量。 以上几方面都有赖于中药有效成分的分析。而中药有效成分的分析有 其特殊复杂性，首先是中药品种繁多，不同品种间活性成分的含量相 差悬殊 ; 其次中药中有效成分还受产地、栽培、生长环境和采收季节等 因素的影响。对于由多种中药组成的复方制剂，情况就更复杂了。目 前用于中药成分分析的方法有薄层色谱法(TLC) 、气相色谱法 (GC), 高 效液相色谱法 (HPLC)等，其中HPLC法常用，高效液相色谱法，其有 诸多的优点，如柱效高，选择性好，

13、适用面广，但将其用于中草药的 分析时，有下列几个不利因素。 由于中草药成分不但复杂且往往不甚清楚，增加了样品前处理 的困难，容易造成柱污染，严重地影响柱寿命。 液相色谱所消耗的溶剂量大，增加了这种方法的成本，且造成 环境污染。 每根柱的柱效实际上不是很高( 约几千塔板数 ) ，所需分析时间 一般较长。与高效液相色谱相比，高效毛细管电泳在分析中草药时具 有下列几点优越 毛细管柱易于全面清洗，不必担心对柱子的污染而使柱子报废。 简化对样品前处理的要求。 柱效高、分析时间一般比HFLC 短。 由于柱效高，有可能使同一个分离条件适合多种样品中多组分 的分析。 所用化学试剂量少，分析成本低。 分离模式多，适合于中药中存在的各类物质。包括酸性、碱性 和中性的物质，如有机酸、生物碱、黄酮及其贰类、香豆类素、氨基 酸类等化合物的分析。 近 十 几 年 来 发 展 很 快 的 高效 毛 细 管 电 泳 (High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)是一种高效分离技术，它具有高 效(每米理论塔板数在10，以上) 、快速、进样体积小 (一般为 nL 级) 、 溶剂消耗少和抗污染能力强等特点，不仅广泛用于生物大分子如核 酸、多肤和蛋白质等的分析，尤其在中药复杂体系的分析中显示出很 大的优势。本文就是利用毛细管电泳来测中药中的有效组分。