《CXCL12CXCR4生物学轴对舌鳞癌Tca8113细胞生物学行为的研究及AMD3100对其的干预》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CXCL12CXCR4生物学轴对舌鳞癌Tca8113细胞生物学行为的研究及AMD3100对其的干预（78页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、b e原创性声明瀚本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：藿固徉日期：2 v z 年如南日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，
2、可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：期佯日期：弘仡年争月岁口日中文摘要中文摘要研究背景：舌部鳞状细胞癌是口腔颌面部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，它具有：生长速度快，局部侵袭力强，淋巴结转移率高等特点。这些生物学特征，特别是易于向颈部淋巴结转移的特性对患者预后影响很大，因此研究口腔颌面部舌鳞癌细胞的增殖，侵袭及转移对提高患者的治愈率和生存率具有非常重要的意义。趋化因子是一类能够刺激白细胞的趋化性，吸引中性粒细胞、单核巨噬细胞等炎性细胞
3、移动到炎症灶，并增强炎性细胞的吞噬杀伤功能，促进它们释放炎症蛋白和炎症介质，直接参与免疫调节和免疫病理反应的小分子分泌蛋白。趋化因子C X C L l 2 对淋巴细胞有强烈的趋化作用并在发育及免疫系统中起重要作用，其在体内多个器官中都可以表达。C X C R 4 是趋化因子C X C L l 2 的特异性受体，其在体内广泛存在，如淋巴细胞、内皮细胞等。最新研究发现，很多恶性肿瘤细胞表面都可以检测到高表达的C X C R 4 受体，如乳腺癌，直肠癌，胃癌等。恶性肿瘤细胞能够高表达趋化因子受体，同时体内的某些器官能够表达其相关配体，高表达C X C R 4 受体的肿瘤细胞能够在C X C L l
4、2 的趋化作用下，出现器官特异性转移。C X C L l 2 C X C R 4 生物学轴已被证明与多种恶性肿瘤的增殖，侵袭及转移密切相关。故通过研究C X C L l 2 C X C R 4 生物学轴与恶性肿瘤生物学行为的相互关系，为肿瘤的治疗提供新的思路和方法。目的：为了研究探讨C X C L l 2 C X C R 4 生物学轴对舌部鳞状细胞癌生物学行为的影响，本实验旨在通过应用一定浓度的趋化因子C X C L l 2 及C X C R 4 受体的抑制剂A M D 3 1 0 0 ，以体外培养的舌鳞癌细胞为研究对象，检测舌鳞癌细胞C X C R 4受体的表达情况，同时观察研究C X C
5、L l 2 C X C R 4 生物学轴对舌鳞癌细胞增殖，侵袭转移的影响，为舌鳞癌的侵袭转移研究提供部分理论基础。中文摘要材料与方法：1 细胞株：舌鳞癌细胞T c a S l1 3 购自中国科学院上海生命科学研究院2 主要材料：培养基R P M I 1 6 4 0 ，胎牛血清( 杭州四季青公司) ，C C K 8 试剂( S i g m a ) ，D M S O ( 二甲亚砜) ，C X C L l 2 因子( 博奥森) ，A M D 3 1 0 0 ，C X C R 4抗体( 博奥森) ，R N A 提取试剂T R I z o l ( 美国I n v i t r o g e n 公司) ，T
6、 a qD N A 聚合酶( T r a n s g e n e ) ，M a t r i g e l ( 美国B D 公司) ，T r a n s w e l l 小室及配套孔板( c o s t a r公司) 等。3 方法：( 1 )舌鳞癌T c a 8 1 1 3 细胞于含1 0 胎牛血清的R P M l l 6 4 0 培养液( 含1 0 0 U m l 青霉素和1 0 0 9 9 m l 链霉素) ，于3 7 、5 C 0 2 的饱和湿度孵箱中培养，每2 3 天换液一次，0 2 5 的胰蛋白酶消化传代( 2 )制作细胞爬片，通过S P 法细胞免疫组化检测T c a S l1 3 细胞
7、表面C X C R 4 受体的表达( 3 )应用C C K 8 方法检测C X C L l 2 C X C R 4 生物学轴对舌鳞癌细胞T c a S l1 3 增殖的影响及抑制剂A M D 3 1 0 0 对其增殖行为的干预。( 4 )应用P C R ，检测一定浓度的C X C L l 2 及其特异性受体A M D 3 1 0 0 对舌鳞癌T c a 8 11 3 细胞C X C I 受体m R N A 表达量的影响。( 5 )体外应用铺有M a t r i g e l 的T r a n s w e l l 小室，研究C X C L l 2 C X C R 4 生物学轴对舌鳞癌细胞T c a
8、 8 11 3 侵袭转移的影响及抑制剂A M D 3 1 0 0 对其的干预。结果：1 体外培养的舌鳞癌细胞T c a S l l 3 ，生长规律，状态良好，生长曲线近似S形。一般在细胞生长至第2 3 天时进入对数生长期，在镜下，细胞排列紧密，形态不一，此期可行传代或者进行实验研究；l 周左右细胞的增殖及分裂能力开始下降，形态出现变化，凋亡细胞数目增多。2 免疫组化结果示：C X C R 4 受体在4 组中均出现阳性表达，其中C X C L l 2因子刺激组表达量最高，A M D 3 1 0 0 预先孵育组C X C R 4 受体表达量最少，其他两组差别不明显，C X C R 4 受体主要在胞
9、膜上表达，胞浆及核仁表达量较少。3 通过应用R T - P C R ，基因水平检测C X C R 4 受体m R N A 发现，四组均表达中文摘要C X C R 4 受体m R N A ，C X C L l 2 因子刺激组最高，抑制剂A M D 3 1 0 0 预先干预组表达量最低，其他两组差别不明显，表达结果同免疫细胞化学结果基本吻合。4 通过C C K 8 试剂盒检测C X C L l 2 C X C R 4 生物学轴对舌部鳞状细胞癌增殖行为的影响，低浓度的C X C L l 2 因子对T c a 8 1 1 3 细胞的增殖作用不明显，l O O n g m l 浓度的C X C L l
10、2 因子能明显促进肿瘤细胞的增殖，且对T c a 8 1 1 3 细胞的增殖作用随着作用时间的延长，促增值效应越明显。在相同的时间点，l O O n g m l浓度的C X C L l 2 因子刺激组O D 值最高，1 I t g m l A M D 3 1 0 0 预先孵育各趋化因子组，可不同程度的抑制C X C L l 2 因子的促进T e a 8 1 1 3 细胞增殖的作用，其中对于1 0 0 n g m l C X C L l 2 组，抑制其促进肿瘤细胞增殖的作用最明显。5 经各实验组预处理T e a 8 1 1 3 细胞4 8 h 后，通过体外应用铺有M a t r i g e l
11、的T r a n s w e l l 小室，l O O n g m l 浓度的C X C L l 2 因子刺激组的穿膜细胞数量较多，A M D 3 1 0 0 预先孵育组穿膜数量最少，C X C L l 2 因子刺激组，A M D 3 1 0 0 预先孵育组，和对照组之间差异具有统计学意义( P 7 5 为4 ；染色强度分级：无着色为O 轻度着色为l ，中度着色为2 ，更深颜色为3 。表达强度等于两项的得分相乘，结果 l判定为阳性表达，结果S 1 判定为阴性。2 4 细胞增殖实验C C K - 8 ( c e l lc o u n t i n gk i t - 8 ) ，是一种基于W S T
12、8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速，高灵敏的检测试剂。2 3 1 取对数生长期，生长活跃的细胞，0 2 5 D e 胰蛋白酶消化计数，调整细胞浓度为2 x1 0 4 m l ，以每孔1 0 0 1 x l 接种于9 6 孔培养板，每个样品6 个复孔。2 3 2 置于3 7 ，5 C 0 2 的饱和湿度培养箱中培养2 4 小时，细胞贴壁伸展后，设置8 组。( 1 ) 阴性对照组：含有正常培养的T c a 8 11 3 细胞的培养液1 0 0 山( 2 )加入终浓度为l n g m l 的C X C L l 2 因子与培养液的混合液1 0 0 1 d 。( 3 ) 加入终浓度为1 0 n g
13、 m l 的C X C L l 2 因子与培养液的混合液1 0 0 p l ( 4 ) 加入终浓度为1 0 n g m l1 0材料与方法的C X C L l 2 因子与培养液的混合液l O O p l ( 5 ) 加入终浓度为l l x g m l 的A M D 3 1 0 0 + l n g m l 的C X C L l 2 因子与培养液的混合液l O O r a ( 6 ) 加入终浓度为1 瞻m l 的A M D 3 1 0 0 + 1 0 n g m l 的C X C L l 2 因子与培养液的混合液1 0 0 I t l ( 7 ) 加入终浓度为l l a g m l 的A M D
14、3 1 0 0 + 1 0 0 n g m l 的C X C L l 2 因子与培养液的混合液1 0 0 1 d ( 8 ) 单独抑制组：加入终浓度为l 斗g m l 的A M D 3 1 0 0 与培养液的混合液l O O l 且l 。第5 , 6 ，7 组先加入终浓度为l l x g m l 的A M D 3 1 0 0 ，置于3 7 ，5 C 0 2饱和湿度培养箱中预先孵育1 个小时，后加入C X C L l 2 因子调整终浓度，总体积1 0 0 r t l 。9 6 孔培养板边缘孔用灭菌的P B S 封闭。2 3 3 置于3 7 、5 C O ，孵箱中，分别于2 4 小时、4 8 小时
15、、7 2 小时时终止培养，弃去原孔中液体，每孔加入2 0 1 ，L 1C C K 8 溶液和2 0 0 1 d 无血清R P M I 1 6 4 0 组成的混合液，置于3 7 ，5 C 0 2 饱和湿度的培养箱中继续孵育1 个小时。2 3 4 将培养板置于酶联免疫检测分析仪，以空白对照组调零，于4 5 0 n m 测定各孔的吸光度值( O D 值) 。各组6 孔，取平均值，以相对应的吸光度比值来表示不同组的细胞在不同的时间段增殖状况。重复3 次，取平均值。2 5R T - P C R 检测C X C R 4 受体m R N A 的表达变化2 5 1引物2 5 1 1G A P D H 内参照基
16、因引物：S e n s e ：5 T G G A A A T C C C A T C A C C A T C T3 ，A n t i s e n s e ：5 G C C T G C T T C A C C A C C T T C T T3 ，5 S 5 b p ，T m 温度5 7 度2 5 1 2C X C R 4 基因引物：S e n s e ：5 A A A A T C T T C C T G C C C A C C A T 3 ，A n t i s e n s e ：5 A G A C G C C A A C A T A G A C C A C C3 ，3 7 0 b p ，T m 温度5 5 度2 5 1 3 使用时按照试剂公司合成的引物管上的标注，用D E P C 水( p 1 ) 稀释1 0 0倍使用。2 5 2 试验分组2 5 2 1取对数生长期，状态良好的细胞，
