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1、C a l p a i n 在大鼠炎性疼痛模型中作用的研究中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院博士生：王静捷导师：黄宇光教授中文摘要背景：外周组织炎性损伤可以产生对初级疼痛感受器和C 纤维的持续刺激，导致脊髓伤害性神经元的兴奋性增强，进而引起痛觉过敏和触诱发痛。研究证实，转录因子N F r B 是促炎细胞因子、粘附分子以及血管活性介质等可诱导蛋白表达的关键物质，在炎症病理生理过程中发挥重要的作用，并且参与炎性疼痛的形成。同时，大部分通过抑制N F r B 活性来抑制炎性反应的物质也显示出抗伤害性反应的效果。因而，寻找可以抑制N F r , B 活化的物质成为治疗炎性疼痛的方法之一。C a
2、l p a i n 是一种钙离子依赖半胱氨酸蛋白酶，参与许多生理和病理过程。有研究显示，C a l p a i n 可以降解N F r , B 抑制物I r , B a 的P E S T 序列，使N F r B 活化入核，启动后续靶基因的转录。这提示C a l p a i n 可能通过降解I r B a 使N F r , _ B 活化，进而参与炎性疼痛的发生，而如果抑制C a l p a i n 活性则可能缓解炎性疼痛。因此，细致研究C a l p a i n 、1 1 I c B a 、N F r B 表达在炎性疼痛中的变化，以及它们之间的关系可以更加深入的理解炎性疼痛的发生机制，以期发现更
3、具针对性且更有效的疼痛治疗靶点。3第一部分Z y m o s a n 足底炎性疼痛模型大鼠脊髓背角C a l p a i n 活化水平的改变目的：建立Z y m o s a n 足底炎性疼痛大鼠模型，采用行为学和W e s t e r nb l o t 方法，研究z y m o s a n 足底炎性疼痛模型大鼠制模后脊髓背角C a l p a i n 活化水平的变化，以及下游I r d 3 a 、胞核N F r d 3 的表达变化。材料与方法：S p r a g u e D a w l e y 大鼠4 8 只，随机分为3 组，即正常对照组( n _ 8 ，4 8 h 行为学测定结束后处死) 、
4、假手术组( n = 1 6 ，8 只于制模后4 h 处死，8 只继续行为学测量) 以及z y m o s a n 组( n = 2 4 ，分别于制模后4 h 、2 4 h 、4 8 h 处死，每个时间点处死8 只) 。按M e l l e r 方法通过在大鼠左侧后足皮下注射z y m o s a n1 2 5 m g 制作z y m o s a n 足底炎性疼痛模型，假手术组在左侧后足皮下注射同等容积的P B S 。采用V o nF r e y 压力测痛仪分别于制模后O 5 h 、1 h 、2 h 、4 h 、8 h 、2 4 h 和4 8 h 测定各组大鼠左侧后足M W T ，并使用电子数显
5、卡尺测量左足最大厚度。各组大鼠在指定时间点处死后取制模侧腰段脊髓背角，采用W e s t e r nb l o t 方法测定脊髓背角中C a l p a i n 降解底物s p e c t r i na l I 的表达变化以判断C a l p a i n 的活性，并测定下游I r B a和胞核N F l ：B 表达情况。结果：1 与对照组和假手术组相比，z y m o s a n 组大鼠制模后0 5 h 、l h 、2 h 、4 h 、8 h 、2 4 h 和4 8 hM W T 均明显降低( P 一疆，在神经系统内存在许多可以激活N F r J 3 的物质，其中某些是神经系统特异性的，如神经
6、递质谷氨酸通过离子型谷氨酸受体激活N F r B 或神经营养因子。而在神经营养因子中，只有N G F 可以通过与p 7 5 受体结合激活N F r J 3 2 引，其他如N T - 3或N T 4 5 不能激活N F r B 。在小胶质细胞，所有神经营养因子都可以激活N F r B 2 9 1 。一些在免疫系统中发挥抗炎作用的细胞因子如T G F 3 或I L 1 0 在神经系统内也可以抑制N F r B 的活化。目前有关这些细胞因子在神经系统内如何激活N F K ：B的机制尚不完全明确。通过诱导I r B 转录可能是其中机制之一【3 0 】。有些物质在低浓度下可以激活N F r B ，但在高
7、浓度时则是N F r B 活化的抑制剂。固有型N F r B的活性维持是突触活动的结果。通过抑制动作电位的产生、阻断谷氨酸受体或L型钙离子通道可以抑制固有型N F r B 的活性。N F K B 在神经系统内的转录靶基因目前研究尚不完全。已知的基因包括神经细胞粘附分子、i N O S 、肛一阿片受体、脑源性神经营养因子、C a 2 + 钙调蛋白依赖的蛋白激酶I I 和C O X 一2 等【3 l 】。在周围神经系统，N F r B 在周围神经轴突髓鞘形成和雪旺细胞分化过程中发挥重要的作用【3 2 1 。在中枢神经系统，N F r B 的功能主要在于参与学习和记忆( 突触塑形) ，以及神经退行性
8、变和神经保护。p 6 5 或p 5 0 基因敲除小鼠会出现严重的记忆缺失，可能与突触塑形损伤有关【1 9 , 3 3 1 。此外，在神经元细胞中通过I r B 抑制N F r B 的活性可以引起长程增强效应和长程抑制，并导致行为紊乱【3 4 1 。有趣的是，N F r B 既具有神经保护作用，又具有致神经退行性变作用。研究显示，成熟的感觉神经元细胞的生存依赖于T N F 诱导的N F r J 3 活化，而使用d e c o y 寡核苷酸可以消除这种保护效应1 3 5 , 3 6 1 。与此相反，抑制N F r B 的活性还可以保护神经元免受化学介质谷氨酸或红藻氨酸盐的毒性作用【2 3 , 3
9、刀。有研究认为，N F r B 这两种相反的功能可能与它在神经元细胞内的抗凋亡作用和在胶质细胞内的促凋亡作用有关【3 8 1 。三N F K B 在疼痛中的作用C h a n 等在足底注射弗氏佐剂大鼠疼痛模型中，通过电泳迁移率变动分析( E M S A ) 方法观察大鼠腰段脊髓背角N F r B 表达的时程差异性。结果发现，弗氏佐剂注射后l hN F r B 达到高峰，随后即刻早期基因c F o s 在制模后3 h 达到高5 7峰，神经原型一氧化氮合酶( n N O S ) 在4 8 h 达到高峰，而痛阈在6 h 达到最低。该结果说明N F r B 在弗氏佐剂产生的疼痛模型的炎症前状态发挥重要
10、作用，并对c - F o s 和n N O S 的表达起调节作用【3 9 1 。C a b r i n i 等发现在肾上腺切除的大鼠模型中，N F r , B 抑制剂脯氨酸二硫氨甲酸酯( P D T C ) 能显著抑制缓激肽引起的皮肤水肿和门静脉收缩效应。因此认为，N F r , B 对缓激肽的基因表达有重要的上调作用，参与炎性疼痛调节【删。此外，还有实验证明N F r , B 、缓激肽及P G E 2 均可激活、敏化伤害性感受器，降低痛训4 。在啮齿类动物的神经病变模型中，N F r , B 报道基因小鼠在坐骨神经横断后，其损伤同侧的脊髓神经元内N F r , B 活性明显上调【4 2 】。
11、当坐骨神经粉碎性损伤后导致腰段D R G 神经元轴突离段后，会出现N F r , B表达水平上调，有研究认为这种现象与成熟的感觉神经元的存活有关【3 6 】。N F r , Bp 5 0 基因敲除小鼠表现出对急性和炎性伤害性刺激的伤害性反应下降现象，提示该亚基在伤害性传递方面发挥重要的作用。这种伤害性反应下降在脊髓水平表现为C O X 一2 表达水平降低。由于野生型小鼠和基因敲除小鼠在炎性水肿方面没有明显差异，因此认为炎性水肿的发生机制与基因敲除小鼠炎性程度减轻并无关系【4 3 1 。另一项研究还表明，p 5 0 基因敲除小鼠对电针疗法的抗伤害反应下降，这也提示N F K Bp 5 0 亚基在
12、伤害性感受方面的作用】。在神经母细胞瘤细胞内，P G E 2 被I L 1 诱导增生是通过N F 量：B 活化后启动下游基因转录介导的【4 5 1 。作为源头D N A ，N F r B 对P G E 2 这种重要的炎性致痛物质具有上调效应。强啡肽是一种内源性镇痛物质，但是局部使用也有痛觉致敏作用，雄鼠神经鞘膜内注射强啡肽引起的痛觉过敏是经常被采用的一种神经病理性疼痛模型。L a u 曲1 i n 等用此模型研究强啡肽与N F r B 的关系时发现，N F r B 抑制剂能显著减少神经鞘膜内注射强啡肽引起的痛觉过敏现象，强啡肽局部应用的致痛作用部分是经N F r , B 介导的【4 6 1 。
13、在类风湿性关节炎患者，在关节炎症的早期和晚期阶段，滑膜组织内的N F r , B明显活化。在小鼠类风湿性关节炎模型中抑制N F K ：B 活化，可以减少细胞因子的产生，缓解疾病严重程度，并延缓疾病发生【4 7 4 8 1 。在偏头痛模型和急性偏头痛发作患者中，也存在N F r B 的活性增强，并对i N O S 进行转录调节 4 9 5 0 。在骨骼疾病中，N F K B 激活子受体( 黜州K ) 及其配体( R A N K L ) 的相互作用也已被发现。R A N K 和R A N K L 在调节破骨细胞的生长和功能方面发挥至关重要的作用【5 1 1 ，5 8当其功能异常时会出现严重而又疼痛
14、的骨骼疾病如骨质疏松。在绝经后妇女中使用R A N K L 单克隆抗体可以延缓骨质吸收【5 2 1 。四N F K B 作为疼痛治疗靶点的可行性许多文献均提示N F r B 在一些伴随疼痛的病理过程中发挥重要作用，因此对N F r B 信号通路的干预可能具有有效的抗伤害作用。N F r B 激活通路，特别是经典的N F r B 激活通路为药物的治疗提供了的不同的靶点。( 一) 受体拮抗剂使用受体拮抗剂抑制膜受体与配体的结合，进而抑制N F _ ：B 活化是最早抑制N F r B 活性的方法。但这种方法不能特异性的单纯抑制N F r B 通路，还可能影响到其他信号转导通路，如M A P K 通路
15、。1 T N F 受体拮抗剂最近的研究显示，T N F 在炎性疼痛和神经病理性疼痛过程中发挥重要的作用。周围神经损伤会导致D R G 和脊髓背角内的T N F 一仅和T N F R 1 表达上调【5 3 , 5 4 】。而抑制T N F a 合成【5 5 , 5 6 1 或拮抗T N F a 受体5 刀可以减轻神经病理性疼痛。N F K ：B抑制剂P D T C 可以阻断神经病理性疼痛模型中T N F 一位诱导产生的长程增强效应，因此可以认为，T N F 诱导的疼痛效应至少部分是通过N F r B 介导的【5 8 】。在炎性疼痛模型中，通过拮抗T N F 信号通路也可以产生抗伤害作用。目前在临
16、床上，已经通过可溶性T N F 受体或抗T N F 抗体与T N F 受体配体结合，阻断T N F 受体信号通路，进而阻断后续信号传导【5 9 1 。2 1 L 1 p 受体拮抗剂I L l 在炎性疾病和自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉硬化、中枢神经系统疾病如多发性硬化、A l z h e i m e r 病、中风中发挥重要的作用。目前针对I L 1 通路及其受体的治疗方法很多。I L 1 R a 已被批准用于治疗类风湿性关节炎。I L 1t r a p 、I L 1 抗体和可溶性I L 1 受体I I 也处于临床研究阶段1 6 0 1 。尽管这些药物的研发主要是用于治疗炎性疾病，但许多研究显示，它们还具有镇痛效应。研究表明，I L 1 受体拮抗剂I L 1 R a 可以缓解I L 邛、福尔马林和辣椒素诱发的痛觉过敏 6 1 - 6 3 1 以及强啡肽诱发的触诱发痛6 4 1 。因为N F r B 是I L
