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1、5 0 6 手段是不充分的，综合形态学、生化反应、胆汁溶菌、奥普托欣敏感试验与Z 种乳胶凝集试验进行系统鉴定是细菌鉴定的准确方法。通过对乳胶凝集与生化反应综合鉴定为肺炎链球茵的生化反应的观察和统计，发现棉子糖发酵的阳性率为7 9 1 ，菊糖为9 3 6 ，存在一定比例的阴性菌株，推测可能与其基因变异相关。但胆汁溶菌试验均为阳性，与2 种乳胶凝集试验相符率很高，说明胆汁溶菌试验是鉴定肺炎链球菌比较可靠的试验方法。另外需要注意的是，肺炎链球菌乳胶凝集试验存在缺陷：实验中作者发现3 株肺炎链球菌样细菌，其奥普托欣敏感，生化反应也与肺炎链球菌完全相同，形态也较为接近，只是菌落较为干燥，但乳胶凝集试验为
2、阴性，分析可能是由于荚膜抗原的丢失( 孓R 变异) ，而导致凝集阴性，要证实尚需要分子生物学方法；另外，在实验中发现有第三届全国细菌耐药监测与临床专题学术会议较多的肺炎链球菌样细菌与肺炎链球菌乳胶试剂凝集，但同时还与L a n e e f i e l d 抗原乳胶试剂中的C群或F 群凝集，分析可能是肺炎链球菌荚膜抗原与C 群及F 群链球菌中的某些种存在抗原交叉，为防止错误鉴定，须将二者结合。在实验中还分离到了7 株耐奥普托欣的肺炎链球菌。关于耐奥普托欣肺炎链球菌文献已有报道，对其耐药机制，据文献报道，是由于染色体上相关基因单点突变导致，发生在编码F 1 F O H + A T P酶的F 0 部
3、分C 亚基上跨膜a 螺旋2 的4 8 ，4 9 ，5 0残基相应的基因区域，而C o g n e 等报告了发生在a亚基跨膜a 螺旋1 上的一种新突变，该突变是a t -p C 基因第1 4 密码子上的一个G 到A 的突变，导致甘氨酸被丝氨酸取代。基因突变直接导致了F z F o H + A T P 酶蛋白结构的变异，使奥普托欣失去作用位点而形成耐药。实时荧光多重P C R 技术结合融解温度曲线分析在临床细菌耐药基因检测中的应用研究陆学东夏成静黄烈王琼刘键林广城韦洁宏利用S Y B RG r e e nI 实时荧光多重P C R 技术，结合融解曲线分析方法建立针对临床常见细菌耐药基因( 大环内酯
4、类耐药基因、B 内酰胺酶类耐药基因) 的多重检测技术平台，指导临床重症感染在细菌药敏试验结果没有报告之前的经验性用药治疗。选取经预先测序验证携带大环内酯类耐药基因e r m A 、e r m B 、e r m C 、m s r A 的葡萄球菌和携带B 内酰胺酶类耐药基因t e r n 、s h v 、c t x - m - 1 组、c t x - m - 9 组的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌作为阳性菌株，在S Y B RG r e e nI 实时荧光多重P C R 反应体系中加入可以扩增不同长度片段和产物具有不同融解温度( m e l t i n gt e m p e r a t u r e ，T
5、 i n ) 的耐药基因引物和质控引物，以阳性携带菌株为检测对象，条件经优化后根据荧光定量曲线和产物特异的融解温度曲线，建立S Y B RG r e e nI 实时荧光多重P C R 检测大环内酯类耐药基因和p 内酰胺酶类耐药基因筛查体系。利用筛查体系对含有一系列浓度梯度阳性菌株的不同临床样本进行检测，确定此筛查体系的灵敏度。用此多重耐药基因检测体系对各种不同临床标本来源的1 3 6 株葡萄球菌、1 1 0 株大肠埃希菌、9 4 株肺炎克雷伯菌以及1 6 2 例临床血液培养样本进行检测，检测结果和表型检测结果、电泳结果、测序结果进行比较。结果显示，耐药基因携带阳性菌株经优化后的S Y B RG
6、 r e e nl 实时荧光多重P C R 扩增，结合融解曲线分析快速筛查体系检测后与预先的测序结果比较，达到1 0 0 的一致性；筛查体系对多重耐药基因的检测灵敏度达到1 0 C F U 菌量，对单耐药基因的检测灵敏度达到1 0 3 C F U 菌量；1 3 6 株葡萄球菌经多重检测体系检测与表型检测结果比较，达到9 4 8 ( 1 2 9 1 3 6 ) 的一致性，与琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果比较达到1 0 0 的一致性。1 0 3 株葡萄球菌被检出携带大环内酯类耐药基因，耐药基因总检出率为7 5 7 ( 1 0 3 1 3 6 ) ；1 1 0 株大肠埃希菌、9 4 株肺炎克雷伯菌经多
7、重检测体系检测和表型检测结果比较达到9 7 1 ( 1 9 8 2 0 4 ) 一致性，第三届全国细菌耐药监测与临床专题学术会议分别有4 2 7 ( 4 7 1 1 0 ) 大肠埃希菌和3 6 2 ( 3 4 9 4 ) 肺炎克雷伯菌被检出携带B 内酰胺酶类耐药基因，与电泳结果及测序结果比较，达到1 0 0 的一致性；1 6 2 例临床血液培养样本经此多重检测体系检测，有1 3 例显示有菌感染，7 例检出携带有大环内醑类或8 内酰胺酶类耐药基因，与表型检测比较达到9 7 5 ( 1 5 8 1 6 2 ) 的一致性，与电泳结果和测序结果比较达到1 0 0 的一致性；统计分析此多重检测技术平台和
8、表型检测比较，差异无统计学意义( P O 0 5 ) 。本研究结果提示，S Y B RG r e e nI 实时荧光多重P C R 技术结合融解曲线分析$ 0 7 方法可以快速筛查和准确检测常见葡萄球菌大环内酯类耐药基因和大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌常见B 内酰胺酶类耐药基因 S Y B RG r e e nI 实时荧光多重P C R 技术结合融解曲线分析方法能够用于临床无菌样本常见大环内醑类耐药基因和G 内酰胺酶类耐药基因的多重检测 此耐药基因多重检测技术平台可以准确快速的应用于检测临床重症感染常见细菌耐药基因，对指导临床医生更合理使用抗生素进行临床治疗和对细菌耐药流行病学监测具有重要价值。儿科
9、患者中分离产金属酶铜绿假单胞菌的分子流行病学研究董方徐樨巍宋文琪吕萍杨永弘沈叙庄金属p 内酰胺酶( m e t a l l o - b a t a - l a c t a m a s e s ， M B L ) 属于A m b l e r 分子结构分类中的B 类和B u s h 功能分类中的第3 组，它有很多型别，自1 9 9 1 年日本首次报道铜绿假单胞菌( P A ) 中发现 I M P 型M B L ，至今已发现P A 可产生的M B L 有 I M P 、V I M 、S P M 和G I M4 种基因型，其引起P A 对口内酰胺类抗生素的耐药已经成为一个全球 性问题。本研究收集儿科患
10、者中分离产M B L 的P A ，探讨其耐药特征和分子流行病学情况。一、材料与方法1 菌株来源：从2 0 0 4 年1 月2 0 0 6 年1 2 月我院住院患儿标本中，分离出产M B L 的P A 4 6 株，包括I M P 阳性3 8 株( 8 2 6 ) ，M 阳性8 株( 1 7 4 ) 。菌株鉴定使用A P I 鉴定系统或B D 微生物分析仪。P C R 检测M B L 基因型：I M P ( F57 一G G A 觚A G A G T -G G C l D 气A 互1 x ? I 。R5 ，G I A 3 K ) ( y n 了峨AA Y 。T T C A j C T ) 、V I
11、 M ( F5 ，C A G 发n K 0 G 茂r X 习卜G T T T G G ，R5 I _ A G G l E G G C C A T T C A ! G O C A G A ) 、S P M 和G I M 型。4 6 株产M B L 菌株分离自不同科别： 血液科1 8 株( 3 9 1 ) ，内科1 8 株( 3 9 1 ) ，硎7基金项目t 国家科技部十五攻关资助项目( 2 0 0 4 B A 7 2 0A 0 9 - 0 1 )作者单位：1 0 0 0 4 5 首都医科大学附属北京儿童医院通讯作者l 拢叙庄，电子信箱，x u z h u a n g s h e n 1 6 3
12、m株( 1 5 2 ) ，外科3 株( 6 6 ) 。标本来源；咽、痰、灌洗液呼吸道标本2 8 株( 6 0 。9 ) ，脓、分泌物9 株( 1 9 6 Z ) ，血液7 株( 1 5 1 ) ，胸水1 株( 2 2 ) ，尿液1 株( 2 2 ) 。2 。药敏试验：对4 6 株产M B L 菌株进行1 2 种抗菌药物M I C 的测定，包括哌拉西林、头孢哌酮、头孢他啶、盐酸头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、氨曲南、头孢哌酮钠舒巴坦钠、哌拉西林三唑巴坦、硫酸庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星。严格按照临床实验室标准化研究所( c L s I ，原N C -C L S ) 推荐的琼脂稀释法测定抗菌药物的M
13、 I C s值。M H 培养基千粉购自O x o i d 公司。抗菌药物盐酸头孢吡肟、氨曲南由中美上海施贵宝公司提供；美罗培南由日本住友制药公司提供；头孢哌酮钠舒巴坦钠( 2 ：1 ) 由辉瑞制药公司提供l 其余购自中国药品生物制品检定所。3 D N A 测序：P ( 、R 反应产物委托上海英骏生物技术公司纯化、测序测序使用双脱氧末端终止法， 在棚P I 砸泓瑚3 7 7 自动测序仪上进行。引物分别采用P C R 扩增m m 型和M 型M B L 的引物，测序作双向测通并拼接。将得到的拼接序列，与G e n t h n k 中B l a s t ( h t t p w w w n c b i n l m n i kg o v b l a s t ) 进行同源分析，确定各基因的型别。4 肠杆菌科基因组内重复一致序列一P C R ( e n -t e r b a c t e r i a lr e p e t i t i v ei n t e r g e n i ec o n s e l l S U SP C R ，
