《动脉粥样硬化兔血管平滑肌细胞钙激活钾通道活性和α亚单位表达的变化》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动脉粥样硬化兔血管平滑肌细胞钙激活钾通道活性和α亚单位表达的变化（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、泸州医学院硕士学位论文动脉粥样硬化兔血管平滑肌细胞钙激活钾通道活性和亚单位 表达的变化姓名：徐春华申请学位级别：硕士专业：心血管指导教师：刘远厚20060501动脉粥样硬化兔血管平滑肌细胞钙激活钾通道活性和0 【亚单位表达的变化摘要目的：研究动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，A S 】时血管平滑肌细胞( v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e l l s ，V S M C s ) 大电导钙激活钾通道( b i gc o n d u c t a n c eC a Z + - a c t i v a t e dK
2、 + c h a n n e l ，B K c a ) 活性和a 亚单位表达的变化及意义。方法：1 A S 模型的建立：选用3 月龄新西兰兔2 0 只，随机分成实验组和对照组，每组2 0 只。实验组饲喂高脂饲料( 含0 5 胆固醇+ 5 猪油+ 1 5 蛋黄粉+ 7 9 5 普通饲料) ，3 周后去掉胆固醇；对照组仅饲喂普通饲料，建模时问共1 2 周。2 A S 模型的鉴定：喂养1 2 周的兔模型经麻醉和抗凝处理后开胸，有动脉粥样硬化斑块病变的胸主动脉组织分别经甲醛固定、石蜡包埋，切片H E 染色行光镜和经戊二醛、锇酸固定，丙酮脱水，0 1 m o l L 磷酸缓冲液漂沈，6 1 8 环氧树脂
3、包埋，切片醋酸铀和硝酸铅染色行电镜观察，对建立的A S 模型进行鉴定。3 膜片钳实验：( 1 ) 急性酶分离获取单个主动脉平滑肌细胞：将胸主动脉小条置于细胞分离液中，进行3 7 “ C 恒温水浴振荡2 0 - 3 0 分钟，使细胞问质及周围的连接组织尽量被酶消化，然后将被充分消化后的主动脉组织放于盛有无钙台式液的小玻璃瓶中，以该液洗涤两次，再用尖端光滑的吸管轻轻吹打，以使单个平滑肌细胞尽可能游离于无钙台式液中，然后用吸管吸出滴于铺在玻璃培养皿中的小载玻片上，放于4 冰箱中静置2 4 , b 时备用；( 2 ) 膜片钳步骤：将特制的毛细玻璃管固定于P P - 8 3微电极拉制器上，拉制成尖端内径
4、约l u m ，充灌电极液后其阻抗约5 8M O的微电极。室温下采用c e l l a t t a c h e d 齐l l i n s i d e o u t 膜片钳单通道技术进行记录。将分离所得的平滑肌细胞放于盛有浴液2 m l 的浴槽内，在倒置相差显微镜下选择符合要求的单个平滑肌细胞进行实验。当电极尖端与细胞膜表面形成高阻封按时，即已形成c e l l a t t a c h e dp a t c h ：然后将电极提出液面，空气中暴露2 - 3 秒，再迅速放回浴液中，形成i n s i d e o u tp a t c h 。分别记录A S 组和对照组V S M CB K c a 开放概
5、率( P o ) ，平均关闭时间( T c ) ，平均开放时问( T o ) 和电流幅值( A m ) ，并对A m 的全点直方图进行函数拟合。4 实时荧光定量P C R ：分析B K c a c t 亚单位编码基因K C M A l 的m R N A 表达水平。T r i z o l 试剂提取各组胸主动脉平滑肌细胞总R N A ，经紫外分光光度计测定O D 2 6 0 O D 2 帅的比值，计算山各组总R N A 的浓度与纯度_ ：j f ：进行统计学分析，并用1 5 琼脂糖凝胶电泳检钡i R N A 分子的完整性。利用逆转录聚合酶链式反应( R T - P C R ) 技术和随机引物将总R
6、 N A 逆转录成c D N A ，分别根据从G e n e B a n k 数据库中检索到的兔K C M A l 基因( A F 3 2 1 8 1 8 ) 和兔G A P D H 基因( L 2 3 9 6 1 ) m R N A 的R e f S e q 序列设计基因特异性引物和探针，实时荧光定量P C R 仪上进行体外扩增c D N A i 将K C M A l 基因c D N A 和兔磷酸甘油醛脱氢酶( g l u c e r a l d e h y d ep h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e ，G A P D H ) 基I 习c D
7、N A 梯度稀释制作各自的标准曲线，根据各个样本循环指数增长期的起始点即循环闽值( c y c l et h r e s h o l d ，C t )和标准曲线斜率值计算各样本起始c D N A 模板量倍数值，以G A P D H 基因作为内参照进行标化，统计分析相同标化条件下各组样本起始模板c D N A 是否存在差异，并由此分析各组样本K C M A l 基因表达的m R N A 是否存在差异。结果：( 1 ) 饲喂1 2 周后镜检( H E 染色) 示对照组的主动脉内皮细胞完整，内膜无增厚，无明显增殖及脂质沉积。A S 组粥样化病灶形成和泡沫细胞堆积，管壁增厚，证实造模成功。( 2 )
8、兔主动脉平滑肌B K c a 开放具有明显的电压和C a 2 + 依赖性，其电导值大。( 3 ) 在c e l l a t t a c h e dp a t c h e s ( 膜电位+ 4 0m v )下，A S 组和对照组的平均关闭时问( C l o s e T i m e ，T c ) 分别为2 4 2 5 7 5 8 3 6 m s和2 5 0 3 9 8 1 7 9 9 6 m s ( p l l x m 0 1 ) 、对D H S - I 诱导的活性和易被I b T x 阻断的特性。B K c a 对膜电压和细胞内钙离子浓度变化敏感，膜去极化和细胞内钙离子浓度上升( 钙火花)可激活
9、B K c a ，K + 短暂外流，使细胞膜复极化，从而抑制兴奋收缩耦联。在生理条件下，B K c a 持续激活并作为超极化因素以对抗血管收缩作用，因此，B K c a 通道被看成是平滑肌张力的负反馈调节因子。动脉粥样硬化( a t h e r o s c l e r o s i s ，A S ) 是一种由多因素引起的慢性炎症过程，是以血管内膜损伤、内皮下脂质沉积、V S M C 增殖和迁移、泡沫细胞形成为主要病理特征的退行性和增生性病变。A S 时，由于血管内皮源性舒张受损、血管紧张度增加和受V S M C 增殖的影响，V S M CB K c a 活性和表达可能发生某些变化，冠状动脉粥样硬
10、化斑B K c a 开放概率在细胞吸附式状态下显著增；9 n t 2 ，提示了B K c a 在A S 时活性增加。0 【亚单位是B K c a 的基本功能单位，决定B K c a 的K + 选择性和c a 2 + 敏感性，在A S 时表达有无变化尚不清楚。本实验拟采用膜片钳和实时荧光定量P C R 技术对A S 时V S M CB K c a 活性和a_ E 单位表达的变化进行研究，为进一步研制抗A S 药物提供直接依据。材料与方法1实验动物本实验采用泸州医学院动物科提供的3 月龄纯系新西兰兔2 0 只，体重( 2 O o 1 ) K g ，雌雄各半，随机分为两组：对照组( 正常组) 和实验
11、组( A s 组) ，每组各1 0 只；并山该科提f J t ；c 可养和观察场地。普通饲料( 本校动物科提供) 。2 主要溶液和试剂2 1电极液( m m o l L )K C I1 0 0 、K - A S P 4 0 、H e p e s l 0 、C a C l 2 0 0 5 、M g C l 2 1 ，p H 7 3 - 7 4 ( K O H ) 。2 2 浴液( m m o l L )K C I4 0 、K - A S P1 0 0 、H E P E S1 0 、E G T A2 、M g C l 21 , p H 7 3 - 7 4 ( K O H ) 。2 3 台式液( m
12、 m o l L )N a C i1 2 7 、K C I5 9 、M g C l 21 2 、C a C l 22 4 、G l u c o s e1 2 、H E P E S1 0 ，p H至7 3 - 7 4 ( N a O H ) 。2 4 无钙台式液( m m o l L )除不含C a C l 2 外，余成分同台式液。2 5 酶液：木瓜蛋白酶5 0 U m l ，D T r 3 0m m o l L ，小牛血清白蛋白1 5 m g m l ，用无钙台式液溶解于小瓶内。2 61 0 0m m o l LC a C l 2 溶液将无水氯化钙( 分子量1 1 0 9 9 ) ( 购自重庆
13、无机化学试剂厂) 1 1 1g ，溶解于1 0 0m l 三蒸水中，搅拌均匀，即可配成，然后放入4 “ C 冰箱中备用。浴液 中游离。2 谳翩；赢：等警删k 。其中 C a 2 + 】。d d 为加入浴液中C a 2 + 的浓度( E G T A 螫合前) ；【c a 2 + 】f r c c 为浴液中游离c a 2 + 浓度( E G T A 螯合后) ：K7 为C a 2 + 与E G T A 表面结合常数，K = 1 0 7 1 ( P H = 7 2 ，2 2 “ ( 2 ) 。当E G T A 浓度为2m m o l L ，浴槽中浴液为2m l时，使浴液中的C a 2 + 浓度( m
14、 o l L ) 达1 0 一，1 0 一，5 x 1 0 ，1 0 ，则需依次补充加入1 0 0m m o l L C a C l 2 溶液的量分别为m 1 ) ：4 4 ，1 7 9 ，1 2 2 ，2 6 。2 75 x T B EI 【l 泳缓冲液制衍称取T r i s5 4g ，硼酸2 7 5 2g ，加入2 0m lE D T A ( 5 0 0m m o l L ) ，先加8 0 0m l 三蒸水，加热溶解后， t J j l I - - 蒸水定容至1 0 0 0m l 。2 81 5 琼脂糖凝胶制备称取琼脂糖0 7 5 9 ，1 T B E5 0m l ，微波炉中熔化，加入电泳
15、槽内待其凝固。木瓜蛋白酶、D 1 T r 、小牛血清白蛋白、A S P 、E G T A 、均购自美国S I G M A公司，H E P E S 购自德国R o c h e 公司，逆转录试剂盒( 日本T a K a R a 公司) 、P C R试剂盒( 由晶美生物公司) 。T r i z o lR e a g e n t ( 美国G i b c o 公司) ，其余为进I S l 或国产分析纯。3 主要实验仪器膜片钳放大器( c E z 2 3 0 0 ，N i h o nk o n d e n ，J a p a n ) ，记忆示波器( v c 1 1N i h o nk o n d e n ，
16、J a p a n ) ，A D D A 转换器( D i g i t a l 一1 2 0 0A x o ni n s t r u e n t ，U S A ) ，微管电极拉制器( P P 8 3 ，N a r i s h i g e ，J a p a n ) ，倒置相差显微镜( I X 7 1 ，O l y m p u s ，J a p a n ) ，三维操纵器( w N2 0 3 ，N a r i s h i g e ，J a p a n ) ，恒温浴振荡器( G F L1 0 8 6 ，G e r m a n y ) ，三通道刺激器( S E N 7 2 0 3 ，N i h o nk o d e n ，J a p a n ) 。实时荧光定量P C R 基因扩增仪，( O P T I C O N2 ，M J ，A m e r i c a n ) 电泳仪( D Y Y - 2 C ，
