《大熊猫主要组织相容性复合体Ⅱ类基因研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大熊猫主要组织相容性复合体Ⅱ类基因研究（95页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学博士学位论文大熊猫主要组织相容性复合体类基因研究姓名：朱亮申请学位级别：博士专业：动物学指导教师：方盛国;万秋红20060606浙江大学博士沦文大熊猫主要组织棚容性复合体l I 类基因研究内容提要大熊猫( A i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) 是我国特有的国家l 级珍稀濒危保护动物。目前仅分布于陕西、四川和甘肃三省的秦岭山脉和岷山、邛崃与凉山山脉等青藏高原东缘的边缘地区。根据国家林业局和世界野生动物基金( W W F ) 截至2 0 0 4 年、历时4 年的对大熊猫及其栖息地的全面调查结果，我国现存野生大熊猫约1 6 0 0 只。一万多年
2、以来，由于受晚更新世冰川末期的影响，以及人类在其漫长的历史发展岁月中对栖息地的逐步蚕食，分布于秦岭、岷山、邛崃、凉山、大相岭和小相岭等六个L L l 系的大熊猫，已成为六个孤立的小种群，且秦岭种群已分化为大熊猫的一个亚种秦岭亚种( A i l u r o p o d a ? 1 1 q i n l i n g e n s i s ) 。大熊猫的人工圈养繁育工程始于2 0 世纪8 0 年代。迄今为止，圈养于世界各地的大熊猫共有1 8 3 只。其中，中国大熊猫保护中心( 卧龙) 及其所属的碧峰峡基地( 雅安) ，以及成都大熊猫繁育研究基地共有大熊猫1 4 3 只，是最大的三个人工圈养种群占圈养大熊
3、猫总数的7 8 。本文在中国大熊猫保护中心( 卧龙) 及其所属的碧峰峡基地( 雅安) 、成都大熊猫繁育研究基地、佛坪国家级自然保护区和楼观台珍稀野生动物救助中心共采集大熊猫秦岭亚种和指名亚种( A i l u r o p o d a m e l a n o l e u c a ) 的6 3 只随机个体的粪便、血液、肝、肾和皮张样品7 3 份，并选择主要组织相容性复合体( M H C )I I 类分子中多态性最高的D R B 和D Q A 位点的第二外显子序列作为分子标记，分别开展了粪便中大熊猫高质量D N A 提取方法的研究和M H C 基因D R B 和D Q A 位点的遗传变异性分析，获得
4、了如下的主要研究结果：1 建立了大熊猫粪便样品长期保存，以及自粪便样品中提取犬熊猫高质量D N A的技术方法，解决了该物种基因组D N A 获取的非损伤性策略，并为其它濒危野生动物基因组D N A 的材料来源提供了借鉴。2 在大熊猫秦岭亚种和指名种中，共发现M H C 基因I l 类分子的D l i B 位点有7个等位基因，分别被命名为A i m e - D R B * 1 、A J m e - D R 斜2 、A i m e - D R B * 3 、A i m e - P R ? * 4 、A i m e - D R 劈5 、A l i n e - D R i P 6 和A i m e -
5、 D R B * 7 。其中，秦岭亚利，在该浙江大学1 撙士论文大熊猫主要组织相容性复合体I I 类基囚研究位点上具有A i m e - D R B l 、A i m e - D R l 萍4 、A i m e - D R B * 5 、A i m e - D R 辟6 和A i m e - D R B 75 个等位基因，且其中的A i m e - D R B 5 、A i m e - D R b * 6 和A i m e - D R I 拌73 个等位基因为秦岭亚种所特有；而在指名亚种中，共有A i m e - D R B * I 、A i m e - D R 睁2 、月砌P 一撕傍3 和A
6、 i m e - D R 劈4 4 个等位基因，且其中的A i m e - D R 傍2 和A i m e - D R 辟3 2个等位基因，为指名亚种所特有。此结果表明，大熊猫秦岭亚种和指名亚种在M H C 基因I I 类分子的D R B 位点上，己因产生了部分的遗传变异而进化形成了各自的特有等位基因，从而在分子水平上，进一步为大熊猫秦岭亚种的形成，提供了佐证。3 在D Q A 位点上，秦岭亚种和指名亚种共有6 个等位基因，分别被命名为A i m e D Q A * 1 、A i m e - D Q 纠 2 、A i m D D Q A * 3 、A i m e D Q A * 4 、A i
7、m e D Q 爿 5 和A i m e D Q 爿 6 ，但秦岭亚种共有全部的6 个等位基因，而指名亚神却只有A i m e - D Q A * 1 、A i m e D 鲫 2 、A i m e D Q A 3 、A i m eD 刨 4 和A i m e D 幽$ 55 个等位基因。进一步分析还发现，成都大熊猫繁育研究基地种群拥有指名亚种的全部5 个等位基因，但中国大熊猫保护中心( 卧龙) 及其所属的碧峰峡基地( 雅安) 种群却缺少该位点中的A i m e D 鲫 3 这一等位基因。4 分别对M H C 的D R B E I D Q A 位点的等位基因数和变异率的分布差异进行分析后发现，
8、秦岭亚种、指名亚种、中国大熊猫保护中心( 卧龙) 、碧峰峡基地( 雅安) 和成都大熊猫繁育研究基地的大熊猫的多样性水平，与其它经历过瓶颈效应的濒危动物相当，但较未曾经历过瓶颈效应的物种为低。5 中国大熊猫保护中心( 卧龙) 、碧峰峡基地( 雅安) 和成都大熊猫繁育研究基地三个人工圈养的大熊猫种群在D R B * 0 D Q A 位点上的杂合度，都低于H a r d y - W e i n b e r g 平衡的标准。经分析本文认为，导致该结果的原因，可能是由于建群者( 奠基者) 的数量较小，不可避免的近交造成D R B 年I D Q A 位点等位基因纯合的缘故。与此同时，本文还发现D R B
9、和D Q A 两个位点的等位基因在秦岭亚种的野生种群中平均分布，但在四J I I 亚种圈养种群中的分布却有所偏向，且尤以成都大熊猫繁育研究基地为甚。这说明在圈养种群中，近交已经在定程度上造成了种群遗传多样性的下降，有必要在圈养大熊猫的繁殖管理中，采取一定的措施，防止遗传多样性的进一步丢失。6 通过对D R B 和D Q A 位点的等位基因抗原结合位点之异义置换相对速率同浙江大学博士论文太熊猫主要组织相容性复合体I I 类基因研究义置换相对速率的比值分析，发现两个位点等位基因的异义置换速率在抗原结合位点上，均远远大于同义置换位点。而在非抗原结合位点上，其异义置换速率则接近甚至小于同义置换相对速率
10、。此结果表明，大熊猫D R B 和D Q A位点的抗原结合位点和非抗原结合位点，具有不同的进化方式，从而为“M H C基因的多态性是由正向选择来维持”的观点，提供了佐证。7 通过邻接法构建的D R B 位点之等位基因进化树，本文发现在该位点的A i m e - D R B I A i m e - D R B * 7 中，等位基因A i m e - D R 毋6 和A i m e - D R 傍7 与其它五个等位基因的，更接近于猫科动物的同源基因。由此推测，大熊猫的M H C基因，具有跨物种进化的特点。8 通过血液总R N A 的提取和反转录检测，证明了大熊猫D R B 和D Q A 位点的等位
11、基因，能够在其体内表达形成蛋白分子以行使与免疫相关的功能。9 根据上述结果，本文提出了在人工圈养种群中如何保护大熊猫等位基因的多态性和平衡种群内等位基因频率的一些建议。关键词：大熊猫；秦岭亚种：指名亚种：粪便D N A ；主要组织相容性复合体( M H C )D R B ；D Q A ；单核苷酸构像多态性( S S C P ) ；遗传多样性；平衡选择跨物种进化：保护建议。6浙江大学博士论文大熊猫主要虮织相容性复台休1 1 类基因研究A B S T R A C TG i a n tP a n d a i l u r o p o d am e l a n o l e u c a ) i sa ne
12、 n d a n g e r e ds p e c i e st h a ti se n d e m i ct oC h i n a C u r r e n t l y 。t h eg i a n tp a n d a sa r er e s t r i c t e dt ot h ei s o l a t e dQ i n l i n gM o u n t a i nr e g i o no fS h a a n x iP r o v i n c ea n dt h eM i n s h a n Q i o n g l a i X i a n g l i n ga n dL i a n g
13、s h a nM o u n t a i n so fS i c h u a nP r o v i n c eo nt h ee d g eo ft h eT i b e t a np l a t e a u ( S c h a l l e re ta 1 19 8 5 ；M a c K i n n o ne ta 1 19 8 9 ；O B d e ne ta 1 19 9 4 ) T h eh i s t o r i c a ls e p a r a t i o nb e t w e e nt h eQ i n l i n ga n do t h e rp o p u l a t i o
14、n sh a sy i e l d e dan e wQ i n l i n gs u b s p e c i e s ( A i l u r o p o d am q m l i n g e n s s ) f r o mt h en o m i n a t eS i c h u a ns u b s p e c i e s ( A i l u r o p o d a ，n m e l a n o l e u c a ) f W a ne ta 1 2 0 0 3 ；W a ne ta l ，2 0 0 5 ) Ac a p t i v eb r e e d i n gp r o g r a
15、 mw a si n i t i a t e di nt h e1 9 8 0 s ，a n dn o wt h e r e1 8 3g i a n tp a n d a si nt h ec a p t i v ep r o g r a m T h eg i a n tp a n d ab r e e d i n gb a s e si nY a a n W o l o n ga n dC h e n g d un o wc o n t a i nl a r g ec a p t i v ep o p u l a t i o n so ft h eS i c h u a ns u b s p
16、 e c i e s c o m p d s i n g1 4 3i n d i v i d u a l s ，r e s p e c t i v e l y ( X i e G i p p s ，2 0 0 4 ) ，I nt h i ss t u d y , w ec o l l e c t e ds a m p l e sf r o m6 3i n d i v i d u a l T h es a m p l e sc o v e r e dt h eb o t hs u b s p e c i e so fG i a n tP a n d aa n db o t ht h ew i l da n dt h ec a p t i v ep o p u l a t i o n s W es e l e c t e dm a j o rh i s t o c e m p a t i b i l i t yc o m p l e x ( M H C
