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1、犬病毒病免疫诊断技术研究进展田克恭农业部兽医诊断中心1 免疫肢体金技术a 1 基本原理免疫胶体金技术的检测原理是以硝酸纤维膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检样品后样品中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金标记韧与之反 应形成红色的可见结果，从而达到检测目的。目前，该项技术已在医学上得到广泛的应用，大多数人的传染病都已经研制成免疫胶体金检测方法。在兽医诊断领域也已开始使用，如犬细小病毒、犬瘟热病毒临床快速诊断 均已开始使用免疫胶体金快速诊断试纸条。1 2 临床应用1 2 1 在我国兽医领域的应用胶体金试纸条作为诊断试剂应用于兽医临床，由于它快速、准确，具有高度特异性和敏感性结
2、果直观可靠，而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过 程同时也减少了困操作引起的误差。虽然在动物医学方面的研究起步较晚，但已经引起兽医界的重视，现在已有用于动物疫病检测的胶体金试纸条面市。如用于检测猪瘟抗体的免疫金标试纸条，检测鸡传染性法氏囊病病毒的免疫金标试纸条以及检测犬细小病毒、犬瘟热病毒的免疫金标试纸条等。可以预见在未来的兽医临床，免疫胶体金技术的应用一定会更加广泛。1 2 2 犬细小病毒免疫金标试纸条的临床应用1 2 2 1 样品采集与制备取病犬的粪便样品1 9 ，加生理盐承5 m l 。充分摇匀后静置5 分钟。1 2 2 2 操作方法窒温下将试纸条水平放置，取上清
3、液3 5 滴，逐滴缓慢滴入试纸条的加样孔( s ) 内，静置2 0 3 0 分钟，观察结果。1 2 ，2 3 结果判定阳性：试纸在c 和T 区位置出现两条平行的紫红色( 或红色) 线i阴性：试纸只在C 区位置出现一条紫红色( 或红色) 线；无效：试纸不出现任何紫红色( 或红色) 线。1 2 2 4 注意事项为确保检测结果准确，请严格按照说明书操作；试纸只能使用一次，请勿重复使用；试纸取出后应在1 5 分钟内使用；包装袋子损坏或密封破按时，请勿使用此袋中的试纸；请勿将不同批号的试纸及其试荆混合使用。2E L I S A 技术 酶联免疫吸附试验( z 珊l i n k e di m r m m o
4、 s o r b e n t s s s a y ，E U S A ) 技术已在兽医学上得到广9泛盼应用，大多数动物传染病都已经研制成E L I S A 检测方法，在犬病毒病诊断中也得到广泛 应用。2 1 基本原理E L I S A 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本( 测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上
5、的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果。使测定方法达到很高的敏感度。2 2 临床应用随着E L I S A 技术的不断发展和完善，在犬病毒性疾病诊断中发挥了重要的作用。经过几年的研究和实际应用，目前E L I S A 技术已经广泛用于犬病毒性疾病的诊断，先后建立了检 测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒I 型、犬腺病毒型、狂犬病病毒等病毒抗体的E L I S A诊断方法，并研制成功商品化的试剂盒。3P C R 技术聚合酶链反应
6、( P o l y m e r a s eC h a i nR e a e d o n ，豫t ) 是一种对特定的D N A 片段在体外进行快 速扩增的新方法。目前已广泛应用到分子生物学研究的各个领域，在犬病毒病诊断中也得到广泛应用。3 1 基本原理P C R 是体外酶促合成特异D N A 片段的一种方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成。即在高温( 9 5 “ C ) 下，待扩增的靶D N A 双链受热变性成为两 条单链D N A 模板；而后在低温( 3 7 5 5 。C ) 情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链D N A 模板结合，形成部分双链；在T a
7、 q 酶的最适温度下( 7 2 ) ，以引物3 端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5 37 方向延伸，合成D N A 新链。这样，每一双链D N A 模板，经过一次鳃链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链D N A 分子。由此可见，该方法一改传统分子克隆技术的模式。不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模 板序列甚至一个D N A 分子扩增1 0 7 1 0 9 倍，大大提高了D N A 获得率。将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下( 2 5 4 x m ) - - 般都可见到D N A 的特异扩增区带。3 2 临床应用在犬病毒性疾病预防中，注射疫苗是一
8、项重要的措施，并在疫病防治中发挥了很大的作用。但不利的是为利用血清学检测方法诊断疫病带来了困难。检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是感染病毒产生的。因此，病原学检测的重要性越来越受到人们的重视。随着P C R 技术的不断发展和完善，在犬病毒性疾病诊断中发挥了重要的作用。经过几年的研究和实际应用，我国先后建立了1 4 种犬病毒性疾病P C R 诊断方法( 见表1 ) 。1 0表1 我国已建立的犬病毒病P c R 检测项目P ( m 检测项目R N A 病毒犬瘟热病毒犬冠状病毒犬副流感病毒D N A 病毒犬细小病毒犬腺病毒I 型犬腺病毒型4 免疫酶组织化学技术免疫组织化学( h 一出s t o d
9、t i s 时) 技术简称免疫组化技术，是组织化学的分支，其主 要原理是用标记的抗体( 或抗原) 对细胞或组织内的相应抗原( 或抗体) 进行定性、定位或定量检测经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖、受体及病原体等都可用相应的特异性抗体在组织、细胞内用免疫组化手段检出和研究。 4 1 基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究 和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助千了解疾病的发病机理和病理过程。免
10、疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特 异催化作用。生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。根据酶标记的部位可将其分为直接法( 一步法) 、间接法( - - 步法) 、桥联法( 多步法) 等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。 4 2 临床应用免疫组化方法不仅可在脏器组织中特异地检出病原，又可发挥病理学
11、检测直观、抗原定位准确的特点，如犬传染性肝炎病毒定位于细胞核内；犬瘟热病毒同时定位于胞质和胞核；狂犬病只定位在细胞质内等。通过免疫组化方法可明确观察到致病病原在组织培养细胞和机体细胞内的生长增殖动态，即病毒从宿主细胞到细胞，从一个部位到另一个部位的扩散过程。免疫组化方法除可用于上述疫病的检测外，还可在脏器组织原位检测出病原的同时观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疫病的发病机理和病理过程。随着免疫组化技术的不断发展和完善。在犬病毒性疾病诊断中发挥了重要的作用。经过几年的研究和实际应用，我国先后建立了8 种犬病毒性疾病免疫组化诊断方法( 见表2 ) 。表2 我国已建立的犬病毒病免疫组化检测项耳检测项目主要检测的脏器组织犬细小病毒病犬瘟热犬传染性肝炎犬腺病毒2 型犬呼肠病毒一3 型小肠肺、脑及其它可见病变的脏器组织肝肺小肠1 2
