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1、1从土壤中分离芽孢杆菌从土壤中分离芽孢杆菌1、实验目的实验目的1、了解生物分离提纯的原理和方法技术 2、掌握从土壤样品中分离和筛选微生物菌种的技术和实验设计思路。 3、掌握平板稀释涂布法、划线接种法、分离筛选菌株的基本原理。 4、初步掌握从土壤样品中筛选芽孢杆菌的基本技术。 5、掌握革兰氏染色和芽孢染色。二、实验原理二、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中 所需的各种条件。 土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。一般地说，在土壤 表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm30 cm 的土层中
2、菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90 温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。芽孢杆菌属的共同特征是：
3、革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP 试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25到75以上；最低生长温度大约5到45；生长最低 pH 值，从7.58到2左右；耐盐范围从低于2%的 NaCl 到25%NaCl；营养明胶（22）7天内液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。三、实验材料三、实验材料1、土壤样品 采集周围有花草的成颗粒状的离地表 10cm 左右的土壤 2、培养
4、基 牛肉膏蛋白胨培养基 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、碘液、孔雀绿水溶液 4、玻璃器皿 烧杯（500ml）1 锥形瓶（250ml）22培养皿15 涂布棒1 移液管（1ml）5 试管5 盖玻片，载玻片若干 5、其他设备及仪器 pH 试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭 菌锅、水浴锅、显微镜、接种环等四、实验步骤四、实验步骤1 1、初筛选、初筛选1.1 样本采集 采集土壤，放到塑料袋中。 1.2 芽孢富集 取 10g 土壤加入 250ml 烧杯中，再加入 90ml 无菌水振荡 10min 制成土壤混悬液。 在 80水浴锅中加热 10 分钟
5、，杀灭菌体，使芽孢得到富集。 1.3 梯度稀释菌悬液 分别另取装有 9mL 无菌水试管 5 支，用记号笔编上用记号笔编上 10-2、10-3、10-4。取已 稀释成 10-1土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌的移液器吸取 1mL 土壤悬液加入 10-2的无菌 水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成 10-2土壤稀释液。同法从 10-2的试管中吸取 1mL 稀释液加入编号为 10-3的无菌水试管中，混匀后即为 10-3土壤稀释液， 同法得到 10-4土壤稀释液。 1.4 涂布平板 用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取 100ul，对号较均匀 地放
6、入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。每个 浓度做 2 个平板（重复） 。37下恒温培养 24h。2、复筛选、复筛选2.1划线接种 在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线， 先在平板培养基的一边作第1次平行划线34条，再转动培养皿约60角， 并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行 划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次 平行划线部分作第4次平行划线（如右图） 。划线完毕，盖上皿盖，倒 置于2829C 温室中培养。 2.2 制片检测 2.2.1 革兰氏染色镜检 涂片、干燥及固定 初染：在做好的
7、涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染 1 分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫 色。3媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面 1 分钟，后水洗。 脱色：除去残水后，滴加 95%酒精进行脱色约 1520 秒，后立即用流水冲洗。 复染：滴加番红染色液，染 35 分钟，水洗后用吸水纸吸干。 镜检：油镜观察染色结果。 2.2.2 芽孢染色镜检 取 37培养 1824h 的芽孢杆菌涂片，干燥，固定。 于涂片上滴人 35 滴 5%孔雀绿水溶液。 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约 45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 倾去染液，待玻片冷却后，水冲
8、洗至孔雀绿不再褪色为止。 用番红复染 l min，水洗。 制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。五、注意事项五、注意事项1、要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。 2、观察结果时要注意滴加药量及反应时间。 3、严格无菌操作，防止污染情况的发生。 4、称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。调 pH 时要小心操作，避免回调。 不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 5、革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。 6、进行染色鉴定时，都应有已知的对照菌种在同等条件下染色，然后进行对比记录结果。7、在芽孢染色中，应注意温度的控制，避免染料在玻片上蒸腾，否则
9、影响实验结果。六、时间安排六、时间安排5 月 20 号 配制培养基并灭菌（另包括培养皿，移液管，试管等） 5 月 21 号 取土壤杀死菌体，稀释菌液，接种芽孢，培养 5 月 22 号 观察，平板划线，培养 5 月 23 号 观察 5 月 26 号 镜检七、实验结果七、实验结果4八、实验分析八、实验分析为了得到纯种，先用梯度稀释菌悬液，用涂布平板法，经培养后，可以在平板培养基表面 形成多个独立分布的单菌落，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是 纯培养，所以我们进行复筛选，再用平板划线法分离菌种，观察菌落特征，菌落特征为扁平、 边缘不整齐，白色表面粗糙有褶皱。然后进行革兰氏染色
10、和芽孢染色，革兰氏染色镜检结果： 呈紫色表明该细菌为革兰氏阳性。芽孢染色镜检结果：芽孢呈绿色，菌体红色。镜检观察结果 不明显，所以我们在革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。革 兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。为了我们提高实验结果的 准确性，配制培养基时，要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。在实验过程中， 严格无菌操作，防止污染情况的发生。 通过这个实验我们感受良多：其一，实验前小组成员的分工与准备工作安排的不充分造成 实验前期比较被动，虽耗费了不少时间，但经过调整实验有条不紊的进行，让我们认识到合作 的重要性，在团队合作中，我们要
11、有团队精神，分工明确，提高效率。其二，在分区划线这部 分，我们组犯了一定的错误，导致大部分的菌种被污染，整个平板长满了菌，起初我们猜测问 题可能出在倒平板培养基时没冷却就倒入平板中造成平板盖上残留大量的水珠，以致造成菌种 的大面积的扩散。事后请教其他同学才发觉是我们分区划线时可能是没有做到严格的无菌操作， 导致菌种被污染。通过这次的教训让我更意识到无菌操作的重要性。其三，综合实验的方案设 计和实验操作让我们体验到了耐心、恒心、细心的重要，让我们充分认识到做实验时要一丝不 苟。如果因为一时的粗心而导致一些细小的错误，就会带来不必要的麻烦，甚至会导致试验的 失败，所以我们一定要严格按照试验要求操作。
