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1、中国免疫学会中医药免疫分会织学的和免疫组织化学分析证明三个胚层的结构存在。尽管形成畸胎瘤能力认为是最严格的人细胞的试验，但是没有像小鼠细胞那样严格。因此，开始了体外定向分化的实验加上体外移植模型一道，评估h i P S C s m E S C s 特异性细胞类型的功能。除证明多潜能性外，关键能确保所获得的i P S C s 没有遗传畸变。重编程效率的计算和报告精确的评估重编程效率对于个体实验之间比较是很关键的，尤其优化程序和不同细胞类型重编程的阐释更为重要。绝大多数i P S C 帝U 备都要报告集落形成的频率，集落形成的频率所表示的是接种的每种细胞形成的集落数，到目前为止所报告的大范围数值表
2、明这一测定方法所描述的是不完善推导效率的观点，因此需要将其他变量纳入计算之中。因子转移的差异造成独立实验之间的偏差，例如，病毒效价的偏差导致因子转移的定量差异，因此改变接受所有因子的细胞的比例和最终导致集落形成频率的改变。其他有帮助作用的因素包括细胞集落形成率、细胞存活( 包括增殖和细胞死亡闹亡) 和姊妹克隆的计数( 来自单个细胞的多个i P S C集落) 。组间定量集落数量的特异性方法常常是不同的，这些造成效率有较大差异。这样方法包括形态计数、碱性磷酸酶活性、免疫染色、转基因和敲入报告等位基因的表达和形成O S C 株集落的能力，反映真正O S C 集落的所有方法精确性的差异。尽管形成i P
3、 S C 株的能力是最严格的定量方法，但是作为大量的集落数来说是一项艰辛的方法。敲入报告等位基因或免疫染色的应用都是内源性多潜能基因表达合适的替代方法：然而，形态学鉴定或碱性磷酸酶活性不能有效的指示真正的多潜能细胞集落。转移报告基因的方法也应该谨慎应用，像内源性敲入报告等位基因一样，这样等位基因的表达不能得到同样的调控。在细胞融合过程中O c t 4 报告基因的再激活就是例子，与转基因的等位基因发生融合比内源性敲入等位基因融合快得多。采取很多步骤减少报告频率的差异性、增加真正重编程效率的精确性和可靠性。这些包括( 1 )通过评估表达和共转染控制因子的转移和所报告的值作为所有因子表达的部分，而不
4、是输入细胞的总量：( 2 ) 通过细胞计数或单个细胞接种来计算集落形成率( 3 ) 通过单个细胞接种或整合模式的回顾性分析剔除姊妹克隆计数：( 4 ) 用可靠的和严格的方法去鉴定i P S C 集落。五味子提取物预防辐射所致淋巴细胞减少及其机制刘丽华刘登湘单保恩马鸣 河北医科大学第四医院科研中心河北省肿瘤研究所，河北石家庄，0 5 0 0 1 1放疗是肿瘤患者临床治疗的常规疗法之一，大约有6 0 的癌症患者在治疗中会接受放射治疗。放疗能有效地杀伤局部肿瘤细胞，尤其是适用于肿瘤局限尚未扩散的肿瘤患者。但是放疗也有一定的毒副作用，可强烈抑制患者细胞免疫功能，使癌症患者原来就下降的免疫功能进一步降低
5、是导致肿瘤复发的原因之一。因而，研究辐射对免疫系统损伤的规律并探讨其防治措施，辐射防护的重要内容。五味子S c h i s a n d r aC h m e n s i s ( S C ) 为木兰科植物，分布于东北、华北、湖北、湖南等地，具有润肺、滋肾、止汗、止泻、涩精之功效，可以增强机体免疫功能，抑制中枢神经中枢，抑制呼吸系统，还有抗应激作用。研究表明，五昧子能使家兔脾周围动脉淋巴鞘的小淋巴细胞数日增加，有增强细胞免疫功能的作用。本实验主要研究五味子水煎剂预防小鼠辐射所致的淋巴细胞减少的作用，并探讨其作用机制。l l O第五届全国免疫学术会议论文汇编l 材料和方法1 1 实验动物4 8 只清
6、洁级B A L B C 小鼠，体重1 4 1 6 9 ，雌雄各半，由河北省实验动物中心提供( 动物合格证号为8 0 1 8 3 6 ) 。1 2 药物制备：将五味子粉碎研成粉末，加入蒸馏水，浸泡2 4 小时。然后于1 0 0 “ C 水浴中加热两小时后提取液体成分。采用蒸馏法将五昧子水提取物浓缩，生药浓度为1 0 0 m g m 1 ，置于4 。C 备用。1 3 主要试剂T r i z o l 为I n v i t r o g e n 公司产品，R T - P C R 两步法试剂盒购自P r o m e g a 公司，F a s 、b c l 2 抗体购自B i o l e g e n d 公
7、司。主要仪器：F O T O D Y N E 凝胶成像分析系统和P E 9 7 0 0D N A 扩增仪为美国P E公司，E p i c s - X LI I B E Z K L A N 流式细胞仪和C o u l t e rA c td i f i 2 型血细胞记数仪为美国B e c k m a nC o u l t e r公司。1 4 实验动物的分组给药及照射方法将B A L B C 小鼠随机分为S C 预防治疗组、生理盐水对照( N S )组、S C 对照组( 只给S C ，不照射) 和正常对照组( 只给N S ，不照射) ，每组1 2 只。S C 预防治疗组和S C 对照组给与五味子4
8、 m g g 体重灌胃，N S 组和正常对照组给与生理盐水l m l 灌胃，均连续7 天，灌胃后禁食水3 0 分钟。照射采用6 0 C o 治疗机，源皮距S S D = 8 0 c m ，剂量为6 G y ，照射时将小鼠置于特制的有机玻璃固定器内，头颈部遮蔽，清醒状态下全身均匀照射。1 5 标本的采集于照射后2 4 h 摘眼球采血于E D T A 抗凝管中用于血液分析。无菌剥离胸腺组织，一部分置于8 0 0 C 保存用于提取R N A ，一部分置于1 0 福尔马林4 0 C 固定用于免疫组化检测，另一部分置于7 0 乙醇中4 0 C 固定流式检测备用。1 6 细胞凋亡的检测用网搓法将胸腺组织制
9、成单细胞悬液，离心洗涤后分别加入P I ( 碘化丙啶) ，避光作用3 0 m i n ，用流式细胞仪检测细胞凋亡率( 以g a t e d 值表示) 。1 7R 1 P C R 检测胸腺组织中b c l 2 和F a sm 砒呵A 的表达按T r i z o l 产品说明书提取胸腺细胞总砌叮A ，以P r o m e g a 公司两步法试剂进行R T - P C R ，首先反转录为e D N A ，扩增b c l 2 基因的上游引物为：5 - C G A C r T C ( 近C G A G 触陌汀C C A ( C A G - 3 。，下游引物为5 A a 盯G T ( 托C C A G A
10、 l A G G C A C C ( A G - 3 。( 片段大小为3 8 8 b p ) ；F a s 基因的上游引物为5 - G C TG C AG A CA T GC T GT G GA T C - 3 ，下游引物为5 - T C AC A G C C AG G A G A AT C GC A G - 3 ( 片段大小为4 1 8 b p ) ，I B - a e t i n 基因的上游引物为：5 - A G A 0 G G A 从T C G T G C G T G A C - 3 ，下游引物为：5 C 从T A G T G A T G A C C T C - G C C G T -
11、3 ，( 片段大小为1 3 8 b p ) 。第二步反应条件为：b c l 2 ：9 5 0 C 3 0 s ，6 5 0 C3 0 s ，7 2o C3 0 s ；F a s ：9 5 3 0 s ，5 9o C 4 5 s ，7 2 0 C3 0 s ；I B - a e t i n ：9 5o c3 0 s ，6 0 0 C3 0 s ，7 2 0 C3 0 s ，进行3 0 个循环，最后再于7 2 0 C 延伸5 r a i n 。每个P C R 产物6 山于1 琼脂糖凝胶中8 0 V ，电泳3 0 r a i n ，扩增产物以p a e t i n 基因作内参照，采用g e l -
12、p r oa n a l y s i s 3 1 进行照相扫描并进行密度分析。1 8 免疫组化染色检测小鼠胸腺组织b e l - 2 和F a s 的表达石蜡切片脱蜡至水，室温孵育，高压蒸汽抗原修复，山羊血清封闭，以抗鼠b e l - 2 和抗鼠F a s 抗体为一抗进行常规免疫组化检测。1 9 统计学分析用S P S S1 1 5 软件对所有数据进行统计学处理。数据以均数士标准差( S D ) 表示，各组均数的比较采用单因素方差分析。P 0 0 5 则无显著差异。2 结果2 1 外周血细胞数的分析如表l 结果所示，与正常组相比，N S 对照组经射线照射2 4 h 后外周血自细胞总数和淋巴细胞
13、数量均明显下降( P 0 0 1 ) ，S C 预防治疗组较N S 对照组自细胞总数和淋巴细胞数量均明显升高伊 0 0 1 ) 。表l 各组白细胞和淋巴细胞计数! 鬯墨堡兰壹虫! 茎墨墼竺墨G r o u p W B C ( l 旷L L Y M 卜1 0 几)S Cg r o u p64 3 * 05 6 +41 5 i 03 5 +c o a o lg r o u p37 3 = 02 520 6 O3 7S Cc o n t r o l77 5 08 ”53 9 04 3 4n o m l a l g r o u p7S 4 06 3 +54 7 ：- 04 6 + P O0 1 日小e
14、c o n t r o lg r o u p22 腊腺细胞凋亡检测结罩与正常组相比，N s 对照组经射线照射2 4 1 1 后胸腺细胞凋亡率明显爿高f 分别为2 13 2 * 23 6 和l9 8 02 1 ，P 0 叭) ，S C 预防治疗组较N s 对照组胸腺细胞= ：曰亡幸明显降低( 分别为27 土l0 3 和2 l3 2 25 6 P 00 1 ) ，S C 对照组较N s 对照组无显著性差异。目1m 式检a I 脯目d t S C r o u p ；BC o n t r o lg ”“p ，c S Ct r o lDN o d a lg r o u p23b c 】_ 2 和F m
15、基因存小鼠腾腺组织中的表达N S 对照组经射线照射2 4 h 后胸腺细胞b c l 2 m R N A 表达鞍正常掘明显降低- F a S m K N A 表选明显升高( P 00 1 【) ，S C 预防治疗组较N s 对照组b c l2 m R N A 表选鞍砸常组明显升高F m R N A 表达降低伊c O0 1 1 。ABCDb c l 一2F a sp a c t i n目2 R T P C R 检“k 1 2 “ F B s 在小鼠骑腺组组中的表4AS C 口o u p ；BC o n t r o lg r o u p ；CS Cc O n 们【，DN o r r aa lg m
16、u P24b c l 一2 和F a s 蛋白在小鼠胸腺组织中的表达N s 对照组经射线照劓2 4 h 后胸腺细胞b c 】2 表达较正常组明显降低，F # 表达明显刊高( P O0 1 ) 1S C 预防治疗组较N s 对照组b c l 2 表选明显升高，F a s 表达降低f P 0 叭1 。B口_unc1 1 0 u第五届生目免疫* m 告H 论j 汇*蕊瓣鬻 鬣一鬻ABC目4 胸腺缓免癌组化染色检测F a s 表达As cg T o u p ；BC o n t r o lg r o u p ；CS Cc 。n t m l D N o d a lg r o u p讨论大量临床资抖表明，恶性肿瘤患者细胞免疫低下，伴j 馥免疫功能紊乱。放疗虽然是可抑制肿癌细胞生长的有效方法，但会进一步抑制免疫功能。在正常生理状态下，机体免疫器官的重量及免疫细胞数日维持在一定的范围，且免痊器官的组织形
