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1、山东师范大学硕士学位论文小鼠单精注射和原核置换的初步研究姓名：孔风云申请学位级别：硕士专业：细胞生物学指导教师：李云龙20040426独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：忍厶导师签字：签字日期：20 0 4 年月日取勿删签字日期：20 0 4 # 年月0 7 日硕士
2、论文：小鼠单稍注射和原核置换的初步研究小鼠单精注射及原核置换的初步研究第一部分文献综述第一章小鼠单精注射( I C S I ) 的初步研究第节小鼠精子胞质内显微受精技术的研究简史最初精子胞质内显微受精技术被用于研究动物受精过程的早期事件，如同种和异种配予间质膜的融合、卵子的活化以及雌雄原核的形成。1 9 6 2年H i r o m o t o y 报道向爪蟾卵子中注射同种或异种精子( 人精子) 均可形成雌雄原核，并且注射过程能激活卵子。最早对哺乳动物进行这项研究工作的是U e h a r a 和Y a n a g i m a c h i ( 1 9 7 6 ) ，他们将仓鼠和人的精子分别注入仓
3、鼠卵子内，观察到两种精核均能去致密并可以发育形成雄原核证明雌雄配子质膜融合并非精核去致密和原核形成的必需条件。1 9 8 0 年T h a d a n i 对大自鼠、小鼠、白脚鼠的精卵互作进行了研究，发现在异种受精中卵子的透明带具有种的特异性，但是精子在卵质膜内的解聚及原核形成时，种的差异不是很强。由此证实了I C S l 辅助受精技术进行异种受精的可行性，弥补了一般体外受精技术的不足。此后，各国研究者对精子状态、精子不同成分、精予不同成熟时期的细胞与卵母细胞结合后能否完成正常胚胎发育等问题进行了研究，发现就受精能力而言，精子的表型并不完全反映其基因型( U e h a r a 和Y a n
4、a g i m a c h iR ，1 9 7 6 ；M a r k e r t ，1 9 8 3 1W e s t h u s i n 等1 9 8 4 ) 。Y a n a g i m a c h i ( 1 9 9 8 ) 以小鼠为模型研究I C S I 技术时发现，形态和或活力异常的精子，在体内、外正常条件下不能使卵子受精，但利用I C S I 技术可以使卵子受精，并且可以产生有生殖能力的后代，说明形态和或活力异常精子的基因组不一定异常“1 。Y a n a g i m a c h i ( 2 0 0 1 ) 认为，对于I C S I ，注射的精子不管其形态是否正常或死亡，只要基因组完
5、整就能参与胚胎发育，产生正常后代，因此基因组的完整性是决定注射后精子命运的关键“3 ，O g u r a ( 1 9 9 3 ) 将仓鼠球形精子细胞核注入成熟的卵母细胞质内，结果7 5 的受精卵能分裂成2 细胞。此后小鼠球形精予细胞核的卵胞质内注射也获成功，并得到了试管小鼠。随着堡主丝苎! ! ：垦苎堕生笪塑里堡望垫竺塑兰! 壁壑研究的不断深入，在小鼠方面，不仅成熟精子( 附睾中) 和不成熟精子( 睾丸中) ，甚至球形精子细胞和次级精母细胞的卵胞质内注射都已经成功获得了有生殖能力的后代“。在人类的不育治疗方面，欧洲1 9 9 5 的资料显示，射出精子、附睾精子和睾丸精子胞质内注射的受精率分别是
6、6 4 、6 2 $ U5 2 ，妊娠率分别是2 1 、2 2 和1 9 ，两项指标，三组之间均无显著差异。O o t o 将从牛睾丸分离的精子缅胞和经次级精母细胞体外培养后得到的精子细胞分别注入体外成熟的牛卵母细胞质内，胚胎的囊胚发育率分别是7 1 和8 7 5 1 。K i m 等分别将猪的球形精子细胞和球形精子细胞核注入电激活的猪卵母细胞质内，囊胚发育率分别是2 5 和2 7 ”1 。这些研究使人们发现了各种生精细胞的受精潜力，这对珍稀野生动物的扩繁和人类不育症的治疗都有重要意义。I C S I 技术发展的早期，得到的体外发育胚多数是早期胚胎( U e h a r a 和Y a n a
7、g i m a c h iR ，1 9 7 6 ：T h a n d a n i ，1 9 8 0 ) 。很少发育到桑椹胚和囊胚阶段，以后对I C S I 技术各个环节的改进才使研究有了较大发展。1 9 8 0 年，T h a n d a n i 提出对I C S I 的早期发育而言，关键是卵子的激活，而不是受精。此后，许多研究者便针对精子的预处理和卵子的激活进行了大量研究，结果表明，对精子的预处理和卵子的适当激活可以提高I C S I 的成功率。由于小鼠卵母细胞的细胞膜非常脆弱，进行胞质内精子注射时细胞质很容易从注射创口处涌出而导致整个细胞迅速解体。直到1 9 9 5 年，K i m u r
8、 a 等利用压电脉冲力快速短距离推进的P i e z o d r i v e n 装置才解决了这一问题，小鼠注射卵的存活率由1 6 提高到8 0 ，囊胚率由3 3 提高到6 8 ，产仔率达到3 0 ”1 。P i e z o - - d r i v e n 操作系统很快在人、牛、马等动物也得到了应用。W e i 等试验表明，用P i e z o - - d r i v e n 系统做牛的I C S I ，即使不对精、卵作任何激活处理，囊胚率也能达到2 0 。这使I C S I 的效率和安全性大大提高。今后I C S I 技术主要向更简洁、安全、有效的方向发展。迄今为止，通过胞质内单精注射产生正
9、常后代的动物有：人、小鼠、兔、马、绵羊、牛、猪和猴。其中，人类方面的研究进展很快，人精子胞质内注射的受精率高达6 0 - - 7 0 ，胚胎附着率也达到2 0 或更高。进入9 0 年代，相继在澳大利亚、美国、比利时、加拿大和法国等国家有大批I C S I 的试管婴儿诞生，硕士论文：小鼠单稍注射和原核置换的初步研究该项技术已成为治疗男性不育症的理想手段。我国的同类研究起步虽晚，但也做出了一定成绩。1 9 9 2 年，卢圣忠进行了牛和猪精子的I C S I 研究。1 9 9 3 年罗军报道了兔I C S I 的成功，获得7 0的桑椹胚和囊胚发育率，2 4 细胞胚胎移植后顺产4 只健康仔兔。1 9
10、9 6年黄振勇和陈大元等报道了小鼠I C S I 的成功，获得了小鼠后代”1 。同年，顾文艺、郭志勤将绵羊精子可溶性提取物与单个不运动绵羊精子注入体外成熟的绵羊卵胞质内，结果2 4 细胞，8 1 6 细胞，桑椹胚和囊胚的发育率比不注精子可溶性提取物的发育率均提高，分别是4 4 2 、3 7 8 、2 6 9、5 1 和2 9 8 、1 9 5 、1 7 5 、1 0 3 ，证明精子和精子提取物共同注射具有明显促进胚胎发育的作用“。D a l e ( 1 9 9 8 ) 和W i t a k e r ( 1 9 9 0 )提出，精子在与卵子融舍时向卵胞质内释放一种可溶性因子，促使钙离子释放，从而
11、使卵子受精。精子提取物可能就是促发钙离子释放，使卵子受精的激活信息或可溶性因子。1 9 9 9 年，李子义进行小鼠精子和球形精子细胞的I C S I 研究，注射卵的存活率、受精率、卵裂率、囊胚率分别为2 1 4、3 5 5 、3 2 3 、2 0 O “。近年黄振勇、高绍荣与陈大元等揭示了次级精母细胞和次级卵母细胞在同步发育过程中，卵胞质中的减数分裂启动因子能激活次级精母细胞和次级卵母细胞同时进行减数分裂，放出极体，出现1 个受精卵排出2 个雌极体和2 个雄极体( 暂定名) 的现象，胞质中观察到双原核的出现n 2 1 。在人的显微辅助受精技术研究方面，中山医科大学附属医院庄广伦等于1 9 9
12、6 年首次在我国获得成功，从此打破了我国显微试管婴儿“0 ”的记录“”。第二节精子胞质内显微受精的基本操作程序精子胞质内显微受精技术包括精子和卵子的准备或处理，精子的注射，注射卵的激活，注射卵体外发育情况的观察。一精子或精核的准备新鲜的或冷冻一解冻的精子均可用于注射，使用前也要视试验设计的需要做若干处理。如精子的孵育获能及超声波处理( T h a d a n i ，1 9 8 0 ；M a r k e r t ，1 9 8 3 ) ；精子的冷冻一解冻处理；除去精子尾部及顶体制备精核：精子孵育液中加入聚乙烯吡咯烷酮( p o h y v i n y lp y r o l i d o n e ，P
13、 V P - - 3 6 0 ；K e r f e r 等4硕士论文：小鼠单稍注射和原核置换的初步研究1 9 8 9 ) ，一方面使游动的精予丧失游动力，便于注射时的捕捉，另一方面经这样处理的精子不容易粘在注射管壁上，有利于精子的释放；精子孵育液中加入二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t o l ，简称D T T ) ，对某些种类动物精核的解聚有一定作用，可以提高雄原核的形成率。二卵子的收集和处理进行I C S I 的动物卵子可以用激素超排的方法获得，也可以通过收集屠宰场的卵巢，抽取未成熟卵子，进行体外成熟来获得。成熟的卵子在注射前要做某些处理，如用透明质酸酶除去卵子周
14、围的卵丘细胞( T a d a n i ，1 9 7 9 ) ，或做离心处理使其透明化，有些种类动物的卵子在注射前还需人工激活。选择已经排出第一极体并且形态正常、质量较好的卵子，置入油盖微滴，即可备用。三精子或精核的显微注射显微注射有常规和压电素子微操作仪( P i e z o - - d r i v e n ) 操作两种方法，两者主要在注射管及驱动力上有所区别。微注射管的内径只能比精子头部的直径稍大一点，各种动物精子头部的直径不同，所用管子的直径也不同，小鼠精子的注射管内径一般为5 微米，人精子的注射管内径一般为7 微米。显微操作时，如果用有活力的精子做注射，则挑选活力好的精子，破坏其尾部中
15、段很小部位的质膜，使其失去活动能力，这个过程即称为制动。因为在正常的受精过程中，精卵质膜融合，精子在卵胞质中释放一种启动卵子激活的因子精子因子( s F ) ，引起C a + 波动，从而激活了卵子。制动的目的就是使精子注入卵胞质后能较快地释放精子因子( s F ) 。精子制动的方法是影响精子因子能否快速释放的主要因素，最常见的方法是用注射管挤压精子尾部进行制动，以后有人用显微操作刀切断尾部的方法，最近有报道用激光进行制动，可以提高制动的效率，保证了精子尾部中段质膜的破裂。精子制动后将其从尾部吸入注射管开口端。注射时，用固定管固定卵子，使卵子的极体朝液滴内相当于时针“1 2 ”点或“6 ”点的位
16、置，注射管在相当于“3 ”点的位置穿过透明带，向着“9 ”点的方向深入卵胞质，先回吸少量细胞质，确定质膜已破裂，再将单个精予连同微量的操作液注入卵胞质内。硕士论文：小鼠单稍注射和原核置换的初步研究四I C S I 卵子的激活除了小鼠、兔、人的卵子受到微注射管的机械刺激就可以直接被激活外，其他哺乳动物，如不用另外的激活处理，其激活率极低。目前激活卵子常用的试剂有乙醇、钙离子载体( I A 2 3 1 8 7 ) 、离子霉素( I o n o m y s i n ) r此外还有物理激活，如电击等。五I C S I 受精卵的培养目前受精卵的培养方法有体内和体外培养。体内培养就是在激话显微注射的卵子之后，体外培养到早期胚胎，再将其以琼脂包裹，移入暂时的中间受体( 如羊、兔) 的输卵管内，培养4 5 天至桑椹胚或囊胚，然后取出进行胚胎移植。这种方法操作较为复杂，成本高，不利于商业化生产，因此，现在一般采用体外培养的方法，即利用输卵管上皮细胞或颗粒细胞做
