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1、内障丸对抗精子抗体阳性大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响内障丸对抗精子抗体阳性大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响内障丸对抗精子抗体阳性大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响【摘要】目的探讨内障丸对抗精子抗体阳性大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响。方法将 Wistar 雌性成年大鼠随机分为 6 组。中药低剂量组（内障丸） 、中药高剂量组（内障丸） 、中药对照组（六味地黄丸） 、西药对照组（醋酸泼尼松片） 、模型组、空白组。从第 1 次免疫后 1 周开始给药，连续 3周。之后检测内障丸对妊娠第 3 天大鼠子宫一氧化氮合酶表达的影响。结果内障丸可明显提高大鼠交配后第 3 天子宫一氧化氮合酶表达，提髙大鼠的窝产仔鼠数。结
2、论内障丸能改善子宫内环境，有利于受精卵着床。【关键词】内障丸抗精子抗体一氧化氮合酶Abstract： ObjectiveTo investigate the expression of iNOS inuterus of antisperm antibody rats treated by NeiZhangpill. MethodsMaturate femal wistar rats were randomly divided into 6groups:NeiZhang pill low dose group;NeiZhang pill high dosegroup;Liuweidihuang
3、pill control group;Prednisone control group;modelgroup;normal group. Therapy began after the first immune and theexpression of iNOS was measured after 3 weekstherapy. ResultsNeiZhang pill could promote the expression of iNOS inuterus and enhance the fetiferous number. ConclusionNeiZhang pill canimpr
4、ove internal uterus environment, facilitate fertilization andimplantation.Key words： NeiZhang pills; Antisperm antibody; iNOS抗精子抗体（AsAb)阳性不孕约占不孕患者的 20%?30%,具有较高的发病率。AsAb 可以通过不同的环节影响生殖过程导致不孕和流产。本实验通过观察内障丸对 AsAb 阳性大鼠受孕后子宫一氧化氮合酶（iNOS)的影响，探讨内障丸对子宫 iNOS 的作用机制。为中药治疗 AsAb 阳性流产及不孕提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 动
5、物Wistar 雌性成年大鼠，体重（180 土 10) g,鼠龄 10 周，成年雄性 Wistar大鼠，体重（250 土 20) g,购自黑龙江中医药大学实验动物中心。内障丸，6 g/袋，黑龙江中医药附属第一医院制剂室提供，批号：031016。六味地黄丸，0.2 g/丸，每丸相当于原药材 3 g，吉林济邦药业有限公司产品。醋酸泼尼松片 5 mg/片，上海信谊药业有限公司产品。硫酸庆大霉素 8 万 u/只，批号 031026，上海第一生化药业公司产品。1.1.3 试剂鼠抗人精子抗体酶免试剂盒由北京华美生物技术公司提供，实验所需其它化学试剂耗材均由哈尔滨市医药公司化学试剂批发站提供。1.2 方法1
6、.2.1 精子膜抗原提取取正常人精液弃精浆，PBS 离心洗涤 5 次，混悬于含 0. 5%NP-40的 Tris-HC1 缓冲液，置 4C 放置 1 h。12 000 r/min 离心 30 min,取上清到透析袋，以 PBS 过夜透析，双缩脲法测蛋白浓度，_20C 保存备用。1.2.2 动物模型建立1用提取的膜抗原伴等体积弗氏完全佐剂，将二者充分研磨混勻，并加入硫酸庆大霉素 10U/只。对除空白组外所有大鼠进行双侧腹股沟处多点皮下注射，每只大鼠注射原量为 0.4 ml，2 周后用精子膜抗原加等体积不完全佐剂，对除空白组外所有大鼠进行双侧腹股沟处多点皮下注射，进行加强免疫每只大鼠注射抗原剂量同
7、上次。1 周后，用精子膜抗原再次双侧腹股沟处皮下多点注射。空白组大鼠于相应时间于相同位置多点注射等体积生理盐水 D1.2.3 分组及给药方法将所有雌性大鼠随机分为 6 组，每组 12 只。中药低剂量组（内障丸 9. 72g ? kg-1 ? d-1),中药高剂量组（内障丸 19. 44 g ? kg-1 d-1),中药对照组（六味地黄丸 0. 8 g ? kg-1 ? d-1)，西药对照组（醋酸泼尼松片 1. 35mg . kg-1 ? d-1),模型组、空白组（等剂量蒸馏水） ，从第 1 次免疫后 1 周开始给药，连续 3 周。1.2.4 交配实验采血 1 周后，再次加强兔疫 1 次，剂量及
8、途径同第 2 次加强免疫，将雌性大鼠与正常成年雄性 Wistar 大鼠按 3: 1 比例合笼，每天上午，以消毒细棉签醮生理盐水，插入大鼠阴道旋转 2 周，取大鼠阴道分泌物，涂于载玻片上，行苏木素（H)伊红（E)染色。观察有无精子细胞，有精子为受孕 0 d。1.2.5 标本取材每组随机取 6 只大鼠，于受孕第 3 天，赴死大鼠。取子宫 4%多聚甲醛过夜,梯度酒精脱水，二甲苯透明，正丁醇过夜，石腊包埋。免疫组织化学方法检测.计量资料组间比较方差分析，组间两两比较采用 t 检验，检验，均采用SPSS11.5 统计软件包处理。2 结果1. 1 药物对交配后 3 d 大鼠子宫 iNOS 表达情况的影响测
9、量采用半定量方法进行，细胞楽被染成棕黄色定为阳性结果，根据每张切片阳性反应颗粒占细胞总数比例定为：阴性（-)：未见阳性颗粒。弱阳性（+ )：阳性颗粒少于 1/3。阳性（+):阳性颗粒小于 2/3 且大于 1/3。强阳性（+)：阳性颗粒大于 2/3。为进行定量统计描述，分别对结果评分为（-）：1 分；（+ ) : 2 分；(+) : 3 分；（+) ： 4 分。每张切片计数 3 个视野，结果见表1。表 1 药物对交配后 3 d 大鼠子宫 iNOS 表达情况的影响(略）由表 1 可见，模型组大鼠 iNOS 表达低于空白组（P0. 05),六味地黄丸组 iNOS 的表达明显低于空白组（P0.05)，
10、内障丸高剂量组窝产仔鼠数与醋酸泼尼松组比无明显差异（P0.05)，与空白组比无差异(P0. 05)。3 讨论采用内障丸治疗 AsAb 阳性不孕及流产，实验结果表明内障丸可以提高大鼠子宫 iNOS 表达，并提高大鼠的窝产仔鼠数，提示内障丸对 AsAb 阳性不孕及流产有一定的预防和治疗作用。祖国医学认为“肾为先天之本，元气之根” ，肾主藏精，精能化气，肾精所化之气，即为肾气。肾精的盛衰，不仅关系到能否受孕，而且始终影响整个孕期。若肾气亏损，便不能固摄胎元而致流产。故肾虚是本病的主要原因，也是治疗时需要解决的首要问题。内障丸是我院自制中成药，方中由海马、鹿鸾、熟地黄、拘杞子、山萸肉、人参等组成2。全
11、方既补肾阴亦补肾阳，使阳生阴长，阴阳平衡，正如景岳全书?妇人规指出：“善治阳者，必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷；善治阴者，必于阳中求阴，则阴得阳升而源泉不断。 ”从而使肾中精气旺盛，阴阳平衡，冲任调和以成胎孕 D催化内源性 NO 生物合成的酶是一氧化氮合酶(NOS), iNOS 是诱导型 NOS。N0/N0S 系统参与女性生殖生理活动,如子宫内膜周期性变化的调节、细胞凋亡、卵泡发育3、卵巢性激素的分泌4、胚胎着床、维持妊娠5与分娩以及平滑肌的增殖分化等。其中以 iNOS 在子宫内膜的表达较显著，功能也较重要1 。NO 参与雌激素启动胚胎着床的信号通路7 ; NO 合成阻滞可能导致胎盘血管形
12、成障碍，从而引发胎盘浅表着床8。NO 在胎盘组织中可通过 MMP9的活性参与胎盘结构和功能调节9。本研究表明模型组大鼠在妊娠第 3 天时子宫内 iNOS 表达比正常对照组明显减少，偶见阳性细胞，而正常对照组大鼠的子宫中则有大量 iNOS 分布，妊娠第3 天正处于大鼠胚胎植入前，此时子宫正在为迎接胚胎做着积极的准备，子宫中 iNOS 的表达对此具有重要意义。iNOS 表达减少会引起 NO 的产量降低，从而可能影响大鼠胚胎的发育和着床，导致妊娠失败，这可能是 AsAb 阳性大鼠生育能力下降的原因之一。中药内障丸可以明显提高子宫内 iNOS 的表达，醋酸泼尼松组 iNOS 表达也较少，甚至找不到阳性
13、细胞。这可能因为地塞米松可以通过抑制 iN0S_A 的转录实现对 iNOS 的抑制作用3，10，糖皮质激素4还可以阻止细胞因子诱导细胞内 iNOS 的合成。所以本研究中醋酸泼尼松可能有抑制iNOS 的作用，导致 iNOS 较少，从而对大鼠的生殖功能产生不利影响。围着床期|子宫内环境出现适应性变化，使胚泡的发育与子宫内膜组织的分化同步，以利于着床。我们研究发现，模型组大鼠的 iNOS 表达低于正常组，说明 AsAb 阳性大鼠胚胎着床期，子宫内免疫环境紊乱，不利于孕卵着床，所以，模型组大鼠胚胎数较少，内障丸高剂量组大鼠子宫 iNOS 的表达情况与正常组相近，有利于孕卵着床，窝产仔鼠数也较理想。本实
14、验通过测定 AsAb阳性大鼠子宫 iNOS 的表达及内障丸对其的影响，探讨 iNOS 与 AsAb 阳性不孕及流产的关系，提示内障丸可以提高妊娠子宫 iNOS 表达，进而改善子宫内环境，从而达到提高生育能力、防止流产的治疗目的。【参考文献】1赖安妮，宋济范，刘仙菊，等.中药胎宝抑制抗精子抗体的实验研究J.中国中西医结合杂志，1997，17 (6) ： 360.2 陈惠铮，王素霞，王秀霞.中药治疗 49 例抗精子免疫性不孕症J.中医药信息，2000, 17 (2)：封 3.3 Chatterjee S， Gangula P R R, Dong YL,et al. Immunocytochemic
15、al localization of nitric oxide synthase III in reproductive organsof fem ate rats during the oestrous cycle J . Histochem J, 1996, 28：715.4 Dunnam RC, Hill MJ， Law son DM, et al. Ovariasn hormonesecretory response to gonadotropins and nitric oxide followingchronic nitric oxide deficiency in the rat
16、 J . Biol Reprod, 1999,60: 959.5 Sladek SM, MagnessR R, Conrad KP. Nitricoxide andpregnancy J . Am J physiology, 1997，272： R441.6 Walsh LS, Ollendorff A, Mershon JL. Estrogen increasesinducible nitric oxide synthase gene expression J . Am J ObstetGynecol, 2003, 188(5):1208.7 Wordinger RJ, Jackson FL, Morrill A. Implantation,deciduoma formation and livebirths in mast cell deficientmice(W/Wv) J . Biol Reprod,1999， 68 (2) ：479.8 王若
