《利用骨髓内皮祖细胞EPCs促带蒂皮瓣血管化的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《利用骨髓内皮祖细胞EPCs促带蒂皮瓣血管化的实验研究（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、沈阳军区总医院整形外科【摘要】目的：采用游离穿支皮瓣进行体表瘢痕切除术后缺损修复，探索穿支皮瓣应用的方法、细节和有效性。方法：2 0 0 5 年1 月至2 0 0 6 年1 0 月施行6 例游离穿支皮瓣移植，均用于瘢痕切除术后缺损修复。其中应用上臂内侧血管穿支3 例，应用股前外侧血管穿支3 例。修复面部3 例，下肢3例。结果：所有皮瓣均顺利成活，皮瓣质地良好。结论：应用游离穿支皮瓣可以较好地修复体表组织缺损，并减少供区的并发症，是体表缺损修复的较好的方法。利用骨髓内皮祖细胞( E P C s ) 促带蒂皮瓣血管化的实验研究宋仁刚柳大烈宋任强周敏茹南方医科大学珠江医院整形科黑龙江佳木斯疾病控制中
2、心A s a h a r a 等首先通过免疫磁珠分离技术，从外周血中分离C D 3 4 + 细胞，并证实了该类细胞有促进血管生长作用。因此，近年来越来越多的学者对E P C 产生兴趣并进行研究。本研究通过观察大鼠骨髓来源的内皮祖细胞( E P C s ) 对皮瓣移植后血管化的影响，探索提高移植皮瓣存活率的方法。 1 材料与方法1 1 材料M 1 9 9 培养液购f l G I B C O 公司，C D 3 4 ，C D l 3 3 ，V E G F R - 2 d x 鼠单克隆抗体( s i g m a 公司) ，F I T C 标记的抗鼠二抗( D A K O 公司) ，P E 标记的抗小鼠
3、二抗( S a n t aC r u z 公司) ，流式细胞仪检测( B e c k m a nD i c k s o n公司) 。1 2 方法1 2 1E P C 采集：W i s t a r 大鼠( 5 只) ，2 4 周；腹腔注射肝素( 5 0 0 0I U l ( g ) ，2 0m i n 后行颈椎脱臼断离脊髓处死。吸取含肝素( 1 0 0 I U m 1 ) 的M 1 9 9 基本培养液( 每升M 1 9 9 培养基1 0 9 ，F B S2 0 ，N a H C 0 32 2 9 ，L 谷氨酰胺3 0 0 ，抗坏血酸3 7 5 m g ，青霉素1 0 万单位，链霉素1 0 万单位
4、) ，冲洗股骨和胫骨骨髓腔，收集骨髓。1 0 0 0 r p m 离。1 0 m i n 去除上层脂肪及组织液，收集管底细胞，用滴管轻轻滴加到密度为1 0 8 3 1 0 3 9 L 的l l i s t o p a q u e 。1 8 0 3 分离液上，2 5 0 0 r p m 离一心2 0 m m ，取界面层的单个核细胞，培养液洗涤，计数备用。1 2 2E P C 富集与培养：f i b r o n e c t m 包被培养皿，细胞以5 1 0 6 c m 2 接种于处理过的培养皿，于3 7 、5 C 0 2 的饱和湿度培养箱中培养。分别收集2 4 小时内贴壁的快速粘附细胞并培养，3
5、天后首次换液，去除悬浮细胞。以后每2 天换液。培养至第7 天，以0 1 2 5 胰蛋白酶0 0 1 E D T A 消化制成单细胞悬液备用。1 2 3E P C 免疫荧光鉴定：制备细胞爬片，丙酮固定1 5 分钟，P B S 冲洗。滴加一抗C D 3 4 ( 1 ：1 0 0 ) ，C D l 3 3( 1 ：l O O ) ，V E G F R - 2 ( 1 ：5 0 ) ，5 0 u l ，4 0 C 过夜。P B S 冲洗，针对C D 3 4 、C D l 3 3 滴力D F I T C 标记的抗鼠二抗( 抗体稀释度为1 ：1 0 0 ) ，针对V E G F R 2 滴加P E 标记的
6、抗小鼠二抗3 7 0 C 孵育4 0 分钟。蒸馏水冲洗，碘化吡啶( P I ) 衬染F I T C 荧光( 1 ：1 0 0 0 ) ，D A P I 衬染P E 荧光( 1 ：1 0 0 0 ) ，室温、5 分钟。1 2 4 流式细胞仪检测：以检N C D 3 4 为例，将待测细胞置于1 5 m lE P 管内，调整每管细胞总量为l1 0 6 个。按优化后浓度滴加小鼠抗大鼠单抗，3 7 孵育l h ，P B S 洗涤；加入P E 标记的抗小鼠二抗，室温孵育3 0 m i n ，P B S 洗涤；1 多聚甲醛固定，并设立同型对照；流式细胞仪检测。1 2 5 实验分组与缺血皮瓣模型建立：雌性4
7、6 周W i s t a r 大鼠，体重5 0 8 0g ，共1 5 只，随机分为实验组( 5 只) 、术后无处理对照组( 5 R ) 、术后注射单纯培养液对照组( 5 只) 。以2 戊巴比妥钠5 0m g k g腹腔注射麻醉，在大鼠腹部，仅保留右侧腹壁下动脉为供应血管制备带蒂皮瓣( 4 0 c m 4 0 c m ) ，然后原位缝合，人为造成皮瓣左侧血供不足。1 2 6 实验动物E P C 移植：实验组动物术后，向尾静脉内注射富集的E P C 细胞，对照组动物不予任何处理，或尾静脉内注射单纯培养液。术后1 4 天，观察皮瓣存活情况，应用立体解剖显微镜观察皮瓣2 5 2不同部位的基底部毛细血管
8、，拍照以图象分析软件计算血管密度。1 2 7 统计方法：应用单因素方差分析A N O V A 与s t u d e n tt 检验进行统计分析。数据以x S D 表示。2结果2 1E P C 的体外培养与鉴定密度梯度离心后，通过台盼兰染色观察，细胞细胞存活率 9 5 。细胞被接种于培养皿后，3 0 分钟出现细胞贴壁并开始伸展。快速粘附细胞，第2 天细胞开始贴壁，第4 天细胞明显增殖，由多角形逐渐伸展，逐渐变成长梭形。细胞培养7 天后C D 3 4 ，C D l 3 3 ，V E G F R - 2 表达呈阳性。原代培养细胞中C D 3 4 ，C D l 3 3 ，V E G F R 2 阳性细
9、胞率，分别为( 4 6 9 7 8 4 7 ) ，( 1 8 3 5 4 0 7 ) ，( 2 8 3 2 6 1 1 ) ；细胞培养7 天时：分别为( 4 8 4 1 5 2 4 ) ，( 1 5 7 6 2 1 2 ) ，( 2 9 9 3 3 2 1 ) 两组数据无统计学差异( P 0 0 5 )2 2E P C 的富集原代快速粘附细胞C D 3 4 。C D l 3 3 ，V E G F R 2 阳性细胞率分别为( 4 6 9 7 8 4 7 ) 、( 1 8 3 5 4 0 7 )、( 2 8 3 2 6 1 1 ) ；细胞培养7 天时：C D 3 4 ，C D l 3 3 ，V E
10、 G F R - 2 阳性细胞率分别为( 4 8 4 1 5 2 4 )、( 1 5 。7 6 2 1 2 ) 、( 2 9 9 3 3 2 1 ) 两组数据无统计学差异( P 0 0 5 ) 。2 3缺血皮瓣移植E P C 后观察皮瓣移植2 周后，实验组( 5 R ) 中，尽管缺少左侧血管供应，但经过注射E P C 后，5 只皮瓣生长良好，无坏死，皮肤色泽正常；术后未加任何处理组( 5 只) 中，5 只均有左侧皮瓣边缘坏死。对照组( 共5 只) 中，5 只皮瓣局部( 左腹侧) 颜色变黑、组织回缩、弹性差、质地变硬。2 4 毛细血管密度毛细血管密度比较，移植E P C 部位血管丰富，色泽鲜红：
11、对照部位血管稀少色泽暗淡。二者差异明显。图象分析软件分析后，实验组( 共5 例) 血管密度为7 6 7 0 8 7 ：对照组( 共5 例) 为1 0 10 2 2 ，统计学存在差异( P 0 0 5 ) 。3 讨论皮瓣移植是临床外科常用的组织修复方法之一，但移植皮瓣对血液供应依赖程度较高，皮瓣移植后由于缺血常常发生坏死，其应用因此受到限制。为扩大皮瓣应用范围，皮瓣移植后血管再生是待解决的关键问题，这也是目前的难题。A s a h a r a 笔b 首次证实人类外周循环血液中存在血管内皮祖细胞( E P C ) ，它参与多种组织血管形成( a n g i o g e n e s i s ) 。但
12、由于循环血液中E P C 含量极少，所以应用E P C 治疗仍存在困难。已有研究证实，成年动物和人骨髓中存在E P C ，有可能成为E P C 可以应用的又一来源。本实验通过富集骨髓来源的E P C ，探索其促进带皮瓣移植后血运重建可行性，希望借此方法提高缺血皮瓣移植后的存活率。骨髓来源的E P C 作为一种原始细胞，具有较强分化增殖能力和生物活性。在特定器官组织内，E P C较终末分化内皮细胞有更强的多向分化能力，能分化成器官特异性的内皮细胞。E P C 是内皮细胞的前体细胞，因此与内皮细胞有许多相似之处，如都表达C D 3 4 等，但也有不同之处，j t H E P C 多呈梭形，表达C
13、D l 3 3 ，E P C 分化成熟后C D l 3 3 下调，因此C D l 3 3 成为区分E P C 与成熟内皮细胞的标志。而E P C体外培养时分化较快，所以体内实验时多早期应用，本实验应用体外培养7 天的E P C 。P e i c h e v 等通过研究发现，通过C D 3 4 ，C D l 3 3 ，V E G F R 2 可以分离纯度更高的E P C 。本研究中，我们所采用f i b r o n e c f i n差速贴壁法富集E P C 。我们发现，原代细胞中以上三种细胞表型表达比率在2 0 3 0 之间，而培养7天的E P C 。在设计缺血皮瓣模型时，我们尝试了不同面积的
14、缺血皮瓣模型。结果显示，通过对照组与实验组大鼠的对比观察，注射E P C 可以明显提高缺血皮瓣存活率及成活质量，而且皮瓣的毛细血管密度比较存在统计学差异。许多学者提出E P C 促进血管新生通过两种机制，即血管形成( a n g i o g e n e s i s ) 和血管生成( v a s c u l o g e n e s i s ) 而在本研究中，通过对局部血管形成的图象分析，我们推测E P C 可能通过促进毛细血管的新生，而达到保证皮瓣存活的目的。皮瓣移植后，及时重建血运是皮瓣存活的关键。通过本研究观察，我们发现大鼠骨髓来源的E P C s能促进皮瓣移植后血管重建。为临床探索提高移植皮瓣存活率的方法提供了理论基础。2 5 3
