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1、 牡丹皮中丹皮酚的薄层层析鉴别牡丹皮中丹皮酚的薄层层析鉴别 第一部分第一部分 方案设计方案设计1 1、实验目的实验目的1.中药的薄层定性鉴别自主设计和实验方法2.掌握薄层色谱法在中药分析中的应用3.掌握高效液相色谱仪在中药分析中的应用 2 2、实验原理实验原理丹皮酚是牡丹皮主要挥发性成分之一，是一种小分子酚类化合物，化学名 2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，为白色或微黄色有光泽的针状结晶，熔点 4951，气味特殊、味微辣、易溶于乙醇和甲醇，在热水中溶解，不溶于冷水。丹皮酚可吸收 UV 光，在硅胶 GF254薄层板上形成暗斑，用对照药材与对照品进行对照，可起到鉴别牡丹皮中丹皮酚的作用。利用高效液相色谱
2、法进行丹皮酚的含量测定。分析时，为了减少实验条件波动对分析结果的影响，常采用随行外标一点法。3 3、仪器与试剂仪器与试剂1.仪器 双槽层析缸、玻璃板 1010cm（厚 3mm） 、毛细管2L、研钵、喷雾瓶 50mL、电吹风、电子天平、三用紫外线分析仪、液相色谱仪、微量注射器、C18反相色谱柱、棕色量瓶（25mL,50mL） 、吸量管、超声提取器。2.试剂 硅胶 GF254、氯化钠、三氯化铁、盐酸、甲醇、乙醇、环己烷、乙酸乙酯、重蒸馏水等。3.试药 牡丹皮药材、丹皮酚对照品。4 4、实验内容与步骤实验内容与步骤（一）定性鉴别（一）定性鉴别1.硅胶硅胶 GF254薄板的制作薄板的制作：称取硅胶 G
3、F2541 份与 3 份 0.3%的羟甲基纤维素钠放入研钵中，研匀，倒入涂布器中，进行涂布（厚度为0.250.5mm） ，取下涂好薄层的玻璃板，于温室下，置水平台上晾干，于 110烘 30 分钟，冷却后放入干燥器中备用。2.供试品制备：供试品制备：取本品粉末 1g，加乙醚 10ml，密塞，振摇 10 分钟，滤过，滤液挥干，残渣加丙酮 2ml 使溶解，作为供试品溶液。3.对照品制备：对照品制备：取丹皮酚对照品，加丙酮制成每 1ml 含 2mg 的溶液，作为对照品溶液。4.点样：点样：用毛细管吸取上述两种溶液各 10l，分别点于同一硅胶 G254薄层板上。5.展开：展开：以环己烷-乙酸乙酯(3：1
4、)为展开剂，上行展开，其展距57cm。取出， 晾干。6.显色：显色：喷以盐酸酸性 5三氯化铁乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。7.检视：检视：供试品色谱中，在与丹皮酚对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝褐色斑点。（二）（二） 含量测定含量测定1.1. 色谱条件：色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(45：55)为流动相；检测波长为 274nm。理论板数按丹皮酚峰计算应不低于 5000。 2.2. 对照品溶液的制备：对照品溶液的制备：精密称取丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每 1ml 含 20g 的溶液，即得。 3.3. 供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：取本品粗粉约 0.5g，精密称定
5、，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理(功率 300W，频率 50kHz)30 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液 1ml，置 10ml 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。4.4. 测定：测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10l，注入液相色谱仪，测定，并计算含量。5 5、注意事项注意事项1.自制的薄层板应平整、均匀、无麻点、无气泡、无污损。2. 展开用的层析缸要洗净烘干，放入板之前，要先加展开剂，盖上表面皿，让烧杯内形成一定的蒸气压。点样的一端要浸入展开剂0.5cm 以上,但展开剂不可没过样品原点。当展开剂上
6、升到距上端0.51cm 时要及时将板取出，用铅笔标示出展开剂前沿的位置。3.在使用高效液相色谱仪前，应了解仪器的结构、功能和操作程序。其开机时先打开工作站，排气泡后再连接泵，最后连接检测器，关闭程序与开机相反。第二部分第二部分 综述综述 丹皮酚在现代医学中有广泛的应用价值。其具有镇痛、抗炎、解热和抑制变态反应的作用。对压尾、醋酸等物理或化学因素所致的疼痛，具有明显的镇痛作用。对由角叉菜胶、蛋清、甲醛、组胺、5羟色胺、缓激肽、二甲苯及内毒素等所致的炎症反应，具有明显的抑制作用。对伤寒菌苗、三联疫苗等引起的体温升高，具有明显的解热作用。对 II、III、IV 型变态反应均具有抑制作用。同时具有镇静
7、、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压等作用，在日化方面，丹皮酚能抑制细胞内 O2-自由基产生，能使皮肤增白，将皮肤中沉积色素还原退色，消淤化斑；同时也具有消炎、消肿止痛、抗过敏、抗病毒等作用。对色斑、肌肉痛、皮肤瘙痒、牛皮癣、带状疮疹、湿疹具有较好的治疗和保健效果，此外，在牙膏、含漱液、牙粉、牙痛水中有较好的作用。所以对牡丹皮中丹皮酚的鉴别有很好的研究价值。丹皮酚为白色或微黄色有光泽的针状结晶，无色针状结晶（乙醇） ，熔点 49-51，气味特殊，味微辣，易溶于乙醇和甲醇中，溶于乙醚、丙酮、苯、氯仿及二硫化碳中，稍溶于水，在热水中溶解，不溶于冷水，能随水蒸汽挥发。丹皮酚可随水蒸气蒸馏，且在紫外光区
8、有强烈吸收，在 274nm 波长处 E（1% 1cm）为 862，利用此性质可用紫外分光光度计进行测定。1在本实验中采用薄层层析法进行定性鉴别，薄层层析可用于证实两个化合物相同；测定混合物中组分的数目；决定适用于柱层析分离用的溶剂；监控柱层析分离；检查通过柱层析、结晶或萃取所达到的分离的有效程度；跟踪一个反应的进程等。薄层色谱可随时改换展开剂、展开方向，随时衍生、显色、观察、检测，方法开发快；灵敏度及分辨率高、分离快速、操作方便、同时分离多个样品、样品预处理简单、设备简单等特点。薄层色谱法应用在药物领域的研究已趋成熟，尤其在质控方面已有许多的报道。采用 TIC 扫描法测定银杏叶浸膏中白果内酯的
9、含量，可得到平均回收率为99.83(RSD=1.78)的结果。该法较高效液相色谱分析简便易行，不需繁杂的前处理，精确度高，可用于银杏叶浸膏的质量控制。例如采用同一块薄层板，同一种展开剂可同时鉴定葛根、黄芩、黄连三味药，并可采用薄层色谱扫描法对葛根素进行定量。该法定性鉴别简便快速、专属性强、重现性好。2本实验采用高效液相色谱法进行含量测定，杨洁等采用 HPLC 法，结果显示丹皮酚在 0.010.55 g/ml 范围内线性关系良好(r = 0.999 6) ，平均回收率 99.87% ，RSD 为 1.46%。该法简便、快速，重现性好，精度高，适用于牡丹皮中丹皮酚的定量分析。实验中试用不同体系和比例的流动相，如甲醇磷酸，甲醇醋酸水，结果以甲醇醋酸水溶液为流动相时丹皮酚的分离效果最好。李海燕等以甲醇 0. 5%磷酸(6040)为流动相，检测波长 274 nm 下应用反相高效液相色谱法对丹皮酚含量进行测定，其检测效果也较为理想。3综合文献资料，采用薄层色谱法进行定性鉴别，高效液相色谱法进行含量测定。参考文献：1国家药典委员会，中国药典，部S.北京：化学工业出版社，2005.2杨洁，贾国强，刘萍，等.HPLC 法测定不同产地牡丹皮中丹皮酚的含量J.科学技术与工程,2006,6(3):299.3李海燕，陈小坚. 牡丹皮中丹皮酚含量动态变化研究J.时珍国医国药, 2000, 11(3)：197
