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1、广州中医药大学博士学位论文大黄素等中药单体对HT-29细胞TLR4表达及MAPKs信号通路的影 响姓名：周联申请学位级别：博士专业：中西医结合基础指导教师：王培训20060401大黄素等中药单体对H T - 2 9 细胞T L R 4 表速及M A P K s 信号通路的影响大黄素等中药单体游H T 一2 9 细脆T L R 4 表达及M A P K s 信号退路的影响博士研究生周联导师协助导师摘要王培训教授王宁生教授溃疡性结肠炎( U l c e r a t i v eC o l i t i s ，U C ) ，又称慢性非特异性溃疡性结肠炎或特发性溃疡性结肠炎，是一种原因不明的慢性肠道炎症性
2、疾病，与克隆氏病统称炎症性肠病( n f l a z r u n a t o r yB o w e lD i s e a s e ，I B D ) 。由于发病率呈上升趋势，发病人群以青、壮年多见，成为严重影响健康的消化道疾病之一，因此，其发病机制和治疗方法一直是全球医学界的研究重点。尽管I B D 的发病机制不十分明了，但现有研究表明与遗传、环境、感染及免疫等多因素相关。近来，人们又关注到T o l l 样受体( T o l l l i k er e c e p t o r ，T L R ) 及多种细胞信号通道与I B D 有关，本项目就是在研究U C 的基础上，发现中药有可能影响到这一环节，
3、因此，选择了大黄素等中药单体对H T 2 9 细胞T L R 4 表达及M A P K s 信号通路的影响，尝试进一步探讨I B D 的病理机制和中药的作用环节。T L R 最初是在果蝇体内发现的一种负责信号转导的跨膜受体，随着研究的深入，根据其同源结构域，人们发现在哺乳动物存在着由多种T o l l 受体构成的T o l l 受体家族( T L R s ) ，共有1 2 种。T L R s 是生物经过数百万年进化后保留下来的宿主防御机制，通过对病原微生物的识别，直接启动抗感染机制。目前，研究较为清楚的有T L R 2 和T L R 4 ，分别识别肽聚糖和脂多糖等，激活转录因子N F 馏，诱导
4、细胞因子和防御素( D e f e n s i n ) 的表达，以及介导炎症介质的释放等。肠道粘膜上皮细胞也广泛表达T o l l 受体，然而，正常情况下，肠道粘膜上皮细胞的T L R 对肠道常驻微生物及其产物呈低反应状态，这与其T o H 受体蛋白的低表达和广州中医药大学2 0 0 6 届博士学位论文一些T o l l 信号通路负调控分子的高表达有关。然而，炎症性肠病时，T L R 的表达升高，引起N F 一馏的活化而启动防御机制，但过度激活N F 1 m ，会扩大炎症反应。丝裂原活化蛋白激酶( M i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i
5、n a s e ，M A P K ) 是介导细胞反应的重要信号系统，包括细胞外信号调节激酶( E x t r a c e l l u l a r s i g n a lr e g u l a t e dp r o t e i nk i n a s e ，E R K ) ，c J u n 氨基未端激酶( c J u na m i n o t e r m i n a lk i n a s e ，J N K ) 应激激活蛋白激酶( S t r e s s a c t i v a t e dp r o t e i nk n a s e ，S A P K ) 、p 3 8 等M A P K 亚族。通过高
6、度保守的三级激酶级联反应的方式传递信号：细胞外刺激使M K K K ( M A Pk i n a s ek i n a s ek i n a s e ) 激活，转而激活M K K ( M A Pk i n a s ek i n a s e ) ，然后通过对苏氨酸( T h r e o n i n e ，T ) 和酪氨酸( T y r o s s i n e ，Y ) 的磷酸化激活M A P K s 。M A P K s 信号传导通路的E R K I E R K 2 、J N K S A P K 、p 3 8 M A P K 参与I B D 的肠粘膜损伤。N F r d 3 是重要的转录调控因子
7、，已知哺乳动物细胞的N F r d 3 蛋白家族包括N F r d 3 1 、N F r d 3 2 、R e l A 、R e l B 和c R e l 五个成员，它们以同源或异源二聚体的形式存在，通常N F r d 3 指p 5 0 p 6 5 异二聚体。N F r d 3 被激活后入核内发挥其转录调节作用，即与特定的1 出序列结合行使其功能，引起相应靶基因的转录激活。N F 1 ( B 的过度活化可以引起多种疾病，在I B D 中，N F r , B 的活化使肠道粘膜上皮细胞分泌大量促炎因子，引起了粘膜上皮的损伤。近年来，结合中医药治疗本病疗效显著，对该病缺乏有效的治疗手段起到了弥补作用
8、，且无明显不良反应。作者在现有项目的实验研究中也发现，中药或中药成分确实能影响防御素的表达或产生，如大黄牡月汤、大黄素、黄连素、辛弗林和黄芪甲苷等。而防御素的表达与T L R 存在密切关系，所以，本研究在原有研究基础上，选用了大黄素等中药单体，在对信号转导的影响方面进行了较为系统的研究。本研究以H T - 2 9 绌胞为研究对象，建立炎症细胞模型，观察不同状态下H T - 2 9 细胞T L R 4 、M A P K s 信号通路、N F r B 及I L - 8 分泌的变化，以及中药对炎症绌胞模型的干预作用。1 实验研究1 1 细胞培养条件的建立采用体外培养细胞的方法，研究了大黄素等中药单体
9、对细胞T L R 4 表达及M A P K s信号通路的影响，选用的细胞为结肠腺上皮癌的H T - 2 9 细胞株，建立和稳定了整个研究工作所需要的细胞培养条件。主要对细胞传代、细胞冻存和细胞复苏条件进行了优化，在此基础上，通过显微镜观察了细胞形态，采用了W S T - 8 和M T T 法测定了细胞增殖曲线。结果显示，H T - 2 9 细胞平铺于培养瓶底面积超过瓶底8 0 时，即可传代比例为1 ：2 ；按5X1 0 6 细胞加入冻存液l m L 冻存；复苏时，液氮罐中取出的细胞，于3 8 。C 迅速在l 2 m i n 内解冻，细胞接种次日贴壁良好。增殖曲线显示，细胞以l 1 0 5 m
10、L 接种后3 - 4 日生长旺盛，此时，细胞处于倍增期前后，适合实验。I I大黄素等中药单体对H T - 2 9 细胞T L R 4 表达及M A P K s 信号通路的影响1 2H T - 2 9 细胞生物学特性及中药单体对其增殖的影响首先观察了中药对H T 一2 9 细胞生长的影响，中药单体大黄素、姜黄素、黄芪甲苷、栀子苷和柚皮苷等与I - I T 一2 9 细胞共培养1 2 h ； D 2 4 h 后，均未发现中药影响细胞的增殖。大黄索与H T 2 9 细胞共培养1 周，亦未见其影响细胞的增殖。以R T - P C R 检测H T 2 9 细胞T L R 4 、M D 2 、8 基因表达
11、；流式细胞术检测其T L R 4蛋白表达。结果表明，H T - 2 9 细胞在无任何刺激剂的条件下，有T L R 4 、M D 一2 和一8叫州A 的低表达，这是该细胞建立炎症的基础。大黄素、姜黄素和黄芪甲苷和栀子苷也不改变其表达量。但L P S 束f J 激后，H T 2 9 分泌儿一8 的量能明显升高，符合炎症状态下的表现，所以，可以考虑给细胞以L P s 刺激建立炎症细胞模型。1 3 炎症细胞模型的建立和中药的干预作用通过R T P C R 法对T L R 4 和M D 2 基因表达的观察发现，1 _ = - F N 可以明显促进他们的表达，符合炎症细胞的特征，所以，也可用于炎症细胞模型
12、的建立。以几一8 分泌情况观察，L P S 与W N 有协同作用，说明可以用于炎症细胞模型的制备。综上所述，I F N 、L P S 和I F N + L P S 均可用于H T 2 9 炎症细胞模型的制备。中药对炎症性细胞模型干预作用的结果显示，I F N 使T L R 4 基因表达上调，黄芪甲苷和大黄素组能抑制I Y N 引起的这种上调作用；I F N 使细胞的M D 一2 基因表达上调，黄芪甲苷组、栀子苷和大黄素可抑制I F N 的上调作用。I L 8 的检测结果发现，黄芪甲苷、栀子苷、大黄素和姜黄素均明显降低由于L P S 和I F N 引起的几一8 分泌增加，以大黄素作用相对较强。总
13、体来看，所选用的中药单体，均有不同程度抑制H T 一2 9 细胞的炎性表现，考虑到大黄素作用较强，后续主要以大黄素为研究对象。不同浓度大黄素对炎症模型细胞分泌m 一8 的影响结果表明，1 0 岫。儿8 0 m o l L的大黄素均能显著降低I F N + L P S 所引起的H T - 2 9 细胞儿- 8 分泌，呈剂量依赖关系，进一步验证了大黄素的作用。1 4 中药对H T 2 9 细胞M A P K s 信号通路的干预作用上述研究是从蛋白或多肽水平观察大黄等中药单体具有抑制模型炎症反应的作用，本实验通过对M A P K s 信号通道系统中E R K J N K p 3 8 的检测，了解大黄
14、素是否通过此环节抑制炎症模型细胞的炎症过程。检测结果显示，L P S 在1 0 n g m L 、1 0 0 n g m L和1 0 0 0 n g m L 剂量时，可明显使E R K 、J N K 和p 3 8 等分子磷酸化增加，即细胞被活化或代谢旺盛，而且，L P S 作用1 5 m i n 时最强，3 0 r a i n 后开始有减弱的趋势。此外，I F N 可以促进L P S 的这种活化作用。所以，在观察大黄素对M A P K s 的作用时选择L P S + I F N 制备炎症细胞模型。大黄素对炎症细胞模型M A P K 信号通道影响的研究结果提示，大黄素能明显抑制炎症细胞模型的J
15、N K 和p 3 8 磷酸化，也有抑制E R K 的趋势，说明大黄素可以影响M A P K s 信号转导系统。1 5 中药对H T 一2 9 细胞N F - v , ：B 信号分子活性的影响为了进一步探讨M A P K 信号通路激活的机制，又对其下游分子N F _ 出活性及含一I广州中医药大学2 0 0 6 届博士学位论文量进行了检测。由于N F 一心活化后不仅含量增加，而且，还会出现转位现象，即活化的N F 一心会穿过细胞的核膜，到达细胞核发挥其效应。利用该特性，通过观察转位现象判断N F K B 活化与否。结果表明，L P S 和L P S + I F N 均能使N F - r J 3 明
16、显转位，大黄素对H T - 2 9 炎症细胞模型N F 一心的活化有明显的抑制作用，并有剂量依赖关系。2 结论H T - 2 9 细胞株可以用于有关T L R 4 、M D 一2 和I L 一8 的研究；L P S 以及L P SS n T d F N的联合刺激可用于H T - 2 9 炎症细胞模型的制备：大黄素、栀子苷、黄芪甲苷、柚皮苷和姜黄素对H T - 2 9 炎症性细胞模型均有不同程度的干预作用；大黄素可抑制H T - 2 9 炎症细胞模型M A P K s 信号通路；大黄素能抑制H T - 2 9 炎症细胞模型N F 一1 c B 的活化；大黄素可能是信号通路或信号分子的抑制剂。3 创新点由于陔项研究具有较好的研究基础，而且项目来源是国家自然科学基金项目，所以，研究的起点较高，有明显的创新性。选题新颖，所研究的信号转导是目前的重点之一；选用的实验方法新，均为近年发展的新技术：初步建立了用于中药研究的技术平台和H T - 2 9 炎症细胞模型；实验结果未见报道
