高压液相色谱仪基本操作步骤

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1、Agilent1100 高压液相色谱仪基本操作步骤高压液相色谱仪基本操作步骤sD 【字体：大 中 小】Agilent1100 液相基本操作步骤(一)、开机：1、打开计算机,进入 Windows NT （或 Windows 2000）画面,并运行 Bootp Server 程序。2、打开 1100 LC 各模块电源。3、待各模块自检完成后，双击 Instrument 1 Online 图标，化学工作站自动与 1100LC 通讯，进入的工作站画面。4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Sh

2、ow status toolbar”，“System diagram”,”Sampling diagram”，使其命令前有“”标志，来调用所需的界面。5、把流动相放入溶剂瓶中。6、打开 Purge 阀。7、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump 选项，进入泵编辑画面。8 、设 Flow：5ml/min，单击 OK。9、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Pump control 选项，选中 On，单击 OK，则系统开始Purge，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续 Purge，直到所有要用通道无气泡为止。10、单击 Pump 图标，出现

3、参数设定菜单，单击 Pump Control 选项，选中 Off，单击 Ok 关泵， 关闭 Purge valve。11、单击 Pump 图标，出现参数设定菜单，单击 Setup pump 选项，进入 Pump 编辑画面，设Flow：1.0ml/min。12、单击泵下面的瓶图标，输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积。单击 Ok。（二）数据采集方法编辑：1、开始编辑完整方法：从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，如上图所示选中除“Data analysis ”外的三项，单击Ok，进入下一画面。2、方法信息：在“Method Comments”中加入方

4、法的信息（如：方法的用途等）。单击 Ok 进入下一画面。3、泵参数设定：（以二元泵为例）在“Flow”处输入流量,如 1ml/min，在“Solvent B”处输入 70.0,(A=100-B) ,也可 Insert 一行”Timetable” ,编辑梯度。在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 单击 Ok 进入下一画面。4、自动进样器参数设定:选择合适的进样方式, 进样体积 1.0ul ,洗瓶位置为 6 号。“Standard Injection”-只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”-可以输入

5、进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injector program”-可以点击 Edit 键进行进样程序编辑。点击 Ok 进入下一画面。5、柱温箱参数设定:在”Temperature”下面的方框内输入所需温度,并选中它,点击”more” 键,如图所示,选中”Same as left”-使柱温箱的温度左右一致。点击 ok 进入下一画面。6、VWD 检测器参数设定:在”Wavelength”下方的空白处输入所需的检测波长,如 254nm, 在”Peak width (Response time)”下方点击下拉式三角框,选择合适的响应时间, 如0.1min (

6、2s)。在 Timetable 中可以“Insert”一行，输入随时间切换的波长，如 1min ，波长=300nm。点击 ok 进入下一画面。7、DAD 检测器参数设定:检测波长: 254nm,BW=30nm, 参比波长=350nm,BW=100nm; 检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽 BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域。参比带宽 BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用 100nm 作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪

7、音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。选中所用的灯。点击 Ok 进入下一画面。8、RID 检测器参数设定:色谱条件: 进样体积: 20ul 。 光学单元温度: Off 。 极性: 正 。 峰宽(响应时间) : 4s 。“Optical Unit Temperature”-若环境温度控制在2,设定为 Off, 若环境温度不稳定,则设定光学单元温度为高于环境温度 5 度,以防样品在池中沉淀。“Peak width”-大多数分析设为 4S，只有在高速分析下设为更短。“Automatic recycling after analysis”-在不进行分析时可以让流动相循环，节省流动相，检测器

8、连续运行，可随时投入使用。点击 RID 图标，选择 RID Control ：Heater 设为 On，若要循环流动相，必须将“Recycling Valve”设为 ON。手动 purge 参比池，将其设为 On，并输入 Purge 时间。 9、FLD 检测器参数设定:色谱条件： 样品：P/N 01018-68704 用甲醇稀释为 1:10。 进样体积：5ul。 柱温箱: 30 。 EX=246nm, EM=317nm ,PMT=10。 响应时间=4s. 停止时间： 出峰完毕。 Excitation A: 激发波长:200-700nm,步长为 1nm,或 Zero Order。 Emissio

9、n: 发射波长: 280-900nm, 步长为 1nm,或 Zero Order。 PMT: 大多数应用适当的设定值为 10,若高浓度样品峰被切平头,则减少 PMT 值。 “Peak width”：大多数应用设为 4s，只有快速分析采用小的设定值。 Multi Ex ： 多波长及光谱（激发）。 Multi Em：多波长及光谱（发射）。 同时可以输入范围 Range、步长 step、采集光谱。10、在“ Run time checklist ”中选中“Data acquisition”，单击 Ok。11、单击“Method”菜单，选中“Save method as”，输入一方法名，如“test”

10、，单击 Ok。12、从菜单 “View”中选中”Online signal” ,选中 Windows 1,然后单击 Change 钮,将所要绘图的信号移到右边的框中,点击 Ok.(如同时检测二个信号,则重复 12,选中 Windows 2)。13、从“Run control ”菜单中选择“Sample info”选项，如上图所示，输入操作者名称，在“Data file ”中选择“Manual”或“Prefix”。区别: Manual-每次做样之前必须给出新名字,否则仪器会将上次的数据覆盖。Prefix在 Prefix 框中输入前缀，在 Counter 框中输入计数器的起始位，仪器会自动命名，如

11、 vwd0001，vwd0002。14、从 Instrument 菜单选择 System on。15、等仪器 Ready，基线平稳，从 Method 菜单中选择“Run method”，进样。（三）、数据分析方法编辑:1、从“View”菜单中，单击“Data analysis”进入数据分析画面。2、从“File”菜单选择“Load signal”，选中您的数据文件名，如下图所示。单击 Ok。3、做谱图优化,从“Graphics”菜单中选择“Signal options”选项，。从 Ranges 中选择 Auto scale 及合适的显示时间，单击 ok,或选择”Use Ranges” 调整。反

12、复进行，直到图的比例合适为止。4、积分: (1)、从“Integration”中选择 “Auto integrate”,如积分结果不理想,再从菜单中选择“Integration Events”选项，选择合适的 Slope sensitivity，Peak width，Area reject，Height reject。(2)、从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。(3)、如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。(4)、单击左边“”图标，将积分参数存入方法。5、打印报告: (1)、从“Report”菜单中选择“Specify report

13、”选项，进入如上画面。(2)、单击“Quantitative Results”框中 Calculate 右侧的黑三角，选中 Percent（面积百分比），其它选项不变。(3)、单击 Ok.(4)、从“Report”菜单中选择“Print report”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则单击 Report 底部的“Print”钮。(四)、关机: 关机前，用 100%的水冲洗系统 20 分钟，然后用有机溶剂冲洗系统 10 分钟（如 ACN），然后关泵，（适于反相色谱柱）。正相色谱柱用适当的溶剂冲洗 退出化学工作站，及其它窗口，关闭计算机（用 shut down 关）。 关掉 Agi

14、lent 1100 电源开关。高压液相色谱高压液相色谱 HPLC 常见故障及排除方法常见故障及排除方法sD 【字体：大 中 小】诊状(一)保留时间变化可能的原因 : 解 决 方 法1.柱温变化 : 柱恒温 2.等度与梯度间未能充分平衡 : 至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱 3.缓冲液容量不够 : 用25mmol/L 的缓冲液 4.柱污染 : 每天冲洗柱 5.柱内条件变化 : 稳定进样条件,调节流动相 6.柱快达到寿命 : 采用保护柱 (二)保留时间缩短可能的原因 : 解 决 方 法1.流速增加 : 检查泵,重新设定流速 2.样品超载 : 降低样品量 3.键合相流失 : 流动相 PH 值保持

15、在 37.5 检查柱的方向 4.流动相组成变化 : 防止流动相蒸发或沉淀 5.温度增加 : 柱恒温 (三)保留时间延长可能的原因 : 解 决 方 法1.流速下降 : 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡 2.硅胶柱上活性点变化 : 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱 3.键合相流失 : 同前(二)3 4.流动相组成变化 : 同前(二)4 5.温度降低 : 同前(二)5 (四)出现肩峰或分叉可能的原因 : 解 决 方 法1.样品体积过大 : 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15% 2.样品溶剂过强 : 采用较弱的样品溶剂 3.柱塌陷或形成短路通道 : 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性

16、条件 4.柱内烧结不锈钢失效 : 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 5.进样器损坏 : 更换进样器转子(五)鬼峰可能的原因 : 解 决 方 法1.进样阀残余峰 : 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 2.样品中未知物 : 处理样品 3.柱未平衡 : 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱) 4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) : 每天新配,用抗氧化剂 5.水污染(反相) : 通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC 级的水 (六)基线噪声可能的原因 : 解 决 方 法1.气泡(尖锐峰) : 流动相脱气,加柱后背压 2.污染(随机噪声) : 清洗柱,净化样品,用 HPLC 级试剂 3.检测器灯连续噪声 : 更换氘灯 4.电干扰(偶然噪声