《p130Cas和paxillin在乳腺癌中的表达及临床意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《p130Cas和paxillin在乳腺癌中的表达及临床意义（66页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o r t h ed e g r e eo fM a s t e rE x ra n dc l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo fpl3O C a sa n d x i l l i n E x p r e s s i o na n dc l i n i c a ls l g n l t l c a n c eO tP1a sa n ap a x l l l mi nh u m a nb r e a s tc a r c i n o m a
2、 B VK ey a n Y a n g，一一S u p e r v i s o r ：P r o f A i q i a n gF e n gS u r g e r yT h et h i r da f f i l i a t e dh o s p i t a lo fZ h e n g z h o uUM a y2 0 1 2L原创性声明l I I II II III I I II I I II II Il Y 2 10 3 9 9 6本人郑重声明：所呈交的学位论文是在导师指导下，独立进行研究并撰写完成的，学位论文没有票窃、抄袭等违反学术道德、学术规范的侵权行为，否则，本人愿意承担由此产生
3、的一切法律责任和法律后果，特此郑重声明。学位做懈杨辫色吼功膀多月日本人根据郑州门或机构大学可以缩印或者位论文或州大学。学位摘要p 1 3 0 C a s 和p a x i l l i n 在乳腺癌中表达及临床意义研究生杨克艳导师冯爱强专业外科学郑州大学第三附属医院河南郑州4 5 0 0 5 2摘要目的p 1 3 0 C a s 和p a x i l l i n 在正常细胞和病理细胞的生存、转移和增殖中扮演支架蛋白的作用。因此，揭示p 1 3 0 C a s 和p a x i l l i n 在肿瘤组织中的表达规律、临床病理意义及其与预后的关系将具有重要的理论意义和实用价值。本研究采用逆转录聚合
4、酶链反应法( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nR T - P C R ) 检测了3 0 例原发性乳腺癌组织、1 5 例癌旁正常乳腺组织、1 0 例乳腺纤维瘤组织中p 1 3 0 C a s 和p a x i l l i nm R N A 的表达水平，并探讨它们与年龄、淋巴结转移、病理学分期、肿瘤大小、组织学分级、激素受体情况等临床病理因素之间的关系，以阐明p 1 3 0 C a s 和p a x i l l i n 在乳腺癌发生发展中的作用。方法R T - P
5、 C R 技术检测p 1 3 0 C a s 和p a x i l l i n 基因表达。检测对象为经病理检查证实的乳腺新鲜组织标本，其中原发性乳腺癌3 0 例( 要求临床资料完整，术前未行放、化疗等辅助治疗的病例) 、乳腺纤维腺瘤1 0 例。另取距癌灶边缘5 c m 以上经病理检查正常的乳腺组织1 5 例进行检测。视统计学分析的性质不同分别采用单因素方差分析、独立样本t 检验、S p e a r m a n 等级相关、P e a r s o n 积矩相关。应用S P S S17 0 统计学软件对数据进行分析。摘要毋士里拿口木1 p 1 3 0 C a sm R N A 在正常乳腺组织和乳腺纤
6、维腺瘤组织中的相对表达值分别为0 4 4 4 4 - 0 0 8 8 、0 4 9 3 4 - 0 0 7 3 ，两者之间的差异无统计学意义( P = - 0 3 9 8 ) 。乳腺癌组织中p 1 3 0 C a sm R N A 的相对表达值为0 9 1 4 - 4 - 0 18 6 ，与对照组相比，表达显著增高沪 O 0 5 ) 。所有病例均经病理学证实。按照1 9 8 7 年全国乳腺癌专业会议制定的病理分类方案，其中浸润性导管癌2 5 例，浸润性小叶癌3 例，黏液癌1 例，髓样癌1 例。病理学分期按照2 0 0 3 年U I C C $ 1 J 定的第6 版乳腺癌p T N M 分期，其
7、中I 期1 1 例，I I 期1 0 例，I 期9 例，发生淋巴结转移1 2 例，无淋巴结转移1 8 例，所有病例术前均未接受过放疗、化疗或内分泌治疗。2 1 3 实验仪器3 K 3 0 台式高速冷冻离心机T G L 1 6 台式高速离心机D 1 4 0 图像记录分析系统H e r n a3 2 0 0 基因扩增仪D Y Y 6 C 型电泳仪P 7 0 D17 T L D 5 微波炉D T 2 0 0 电子计数天平德 雪S i g r n 离心机有限公司苏州江东精密仪器有限公司大连J i m Xs c i e n t i f i c 有限公司珠海黑马医学仪器有限公司北京六一仪器厂佛山市格兰仕微
8、波炉电器有限公司常熟金羊砝码仪器公司3实验材料与方法图像分析系统C a n o nP o e r s h o tG 5 照相机- - 8 0 超低温冰箱- - 2 0 超低温冰箱电子天平K H U V I I 型紫外投射分析仪D Y C P 3 3 A 型电泳槽2 1 4 试剂G A D P H 引物p 1 3 0 c a s 弓l 物p a x i l l i n 弓l 物10 0 b pD N A l a d d e rT r i z o l 试剂盒逆转录试剂盒P C R 扩增试剂盒琼脂糖、氯仿异丙醇乙醇溴化乙锭( E B )D E P C2 1 5 其它实验耗材l m lE P 管0 2
9、 m lP C R 薄壁管2 p l 移液器上海富科光学仪器有限公司日本佳能公司S A N Y O 公司青岛海尔公司同本鸟津公司上海康禾光电有限公司北京六一仪器厂北京三博远志生物技术有限责任公司北京三博远志生物技术有限责任公司北京三博远志生物技术有限责任公司华美生物工程公司上海生工生物工程公司北京全式金生物技术有限公司北京全式金生物技术有限公司郑州大学生化及分生教研室提供郑州大学生化及分生教研室提供郑州大学生化及分生教研室提供美 雪S i g m a 公司郑州大学生化及分生教研室提供美国公司A x y g e n 原装美国公司A x y g e n 原装上海求精生化仪器厂2 2 实验原理本实验
10、采用逆转录一聚合酶链反应法检测p 1 3 0 c a S 和p a X i l l i n 的表达水平，其原理是：提取组织中的总R N A ，以其中的m R N A 为模板，采用O l i g o ( d T ) 弓 物利用逆转录酶反转录生成c D N A ，再以c D N A 为模板进行P C R 扩增，而获得检测基因4实验材料与方法的表达。为保证实验结果的可靠与准确，在扩增目的基因的同时，加入G A D P H ( - - -磷酸甘油醛脱氢酶) 作为内参基因同时扩增，这样避免R N A 定量误差以及各P C R反应体系中扩增效率不均、各孔间温度误差等造成的误差。G A D P H 作为恒量
11、表达的看家基因，也常作为半定量标准。最后进行琼脂糖凝胶电泳，采用计算机自动凝胶分析系统，对电泳条带进行密度扫描，得到检测基因的半定量表达水平。所检测的相对水平= ( R T P C R 下产物电泳带亮度面积G A D P HR T P C R 下产物电泳带亮度面积)2 3P C R 实验过程2 3 1 基因引物的设计利用N C B I 的P r i m e r S 物设计软件，对p 1 3 0 c a s 、p a x i l l i n 、G A D P H 基因进行设计，p 1 3 0 c a s 弓l 物序列为：上游引物5 G G A G C A G G A C G A G T A C
12、G A C A A 3 ，下游引物：5 一C A T T G G G A C C C T T G A C A G C 3 ；扩增片段3 1 9b p 。p a x i l l i n 弓l 物序列为：上游引物5 t Q 蚣G C C 吖蚺G C G Q 蚣T G G G 3 ，下游引物：5 - A G A T G C G T G T C TG C T G T T G G 3 ，扩增片段1 7 3b p 。内参为G A D P H ，上游引物：5 - A A C G G A T T T GG T C G T A T T G - 3 ：下游引5 。C A C A G T C T T C T G G
13、 G T G G C 3 ，扩增长度为5 4 0 b p 。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。2 3 2 实验器具的处理与准备2 3 2 1塑料制品( 包括移液器、E P 管、匀浆管) 先将D E P C 水从容量瓶中倒入瓷缸中，D E P C水完全浸没塑料制品，将D E P C 水打入小移液器内，室温下过夜，然后倒掉D E P C水，将瓷缸用铝箔封口，在高温高压下蒸汽灭菌3 0 分钟，然后置入2 5 0 烤箱内烘干备用。2 3 2 2 玻璃制品玻璃器皿冲净后先浸泡于D E P C 水中，口部裹锡箔纸，再置入2 5 0 “ C 烘箱内烘烤4 d , 时。5实验材料与方法2 3 2 3
14、匀浆器包括剪刀、镊子、研钵等，先洗净后，用蒸馏水冲洗一遍，在2 5 0 。C 高温下( 不需要泡D E P C 水) 烘烤约2 小时，干后置入- - 8 0 冰箱过夜。2 3 3R T - P C R 步骤2 3 3 1研磨组织将高温消毒过的冰研钵置于超净工作台中，取小块组织( 约1 0 0 m g ) 置研钵中，边研磨边加入液氮，直至其变成细颗粒。然后加入T r i z o l l m l ，继续边研磨边加入液氮，保持组织处于固体状态。2 3 3 2 分离R N A将固态粉末状组织在常温融化后转移转移经D E P C 水处理过的干燥的经高温消毒的E P 管，室温下静置5 分钟，加入氯仿0 2
15、 m l ，剧烈震荡1 5 秒混均，于室温下静置2 3 分钟使之发生沉淀。在4 、1 2 0 0 0 r p m 冰冻离心机离，t , 1 5 分钟，此时上清液即含所需之全部R N A 。2 3 3 4 沉淀R N A将上清液转移至另一E P 管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒几次将其混均，室温下静置1 0 分钟，在4 “ C 、1 2 0 0 0 r p m 下离- L , 1 5 分钟，此时I A 即沉淀于管底。2 3 3 5 洗涤R N A弃全部上清液，在E P 管底部白色沉淀物中，加入7 5 冷乙醇l m l ，轻轻颠倒混匀，清洗悬浮沉淀，在4 “ C 、9 0 0 0 r p m
16、 冰冻离心机离一I 二, 1 0 分钟，弃上清液，室温晾干。2 3 3 6 溶解R N A在E P 管中加入D E P C 水l m l 溶解R N A ，冻存于- - 8 0 冰箱中备用。2 3 4 逆转录反应合成e D N A实验材料与方法R e a c t i o nM i xl O “l ；E a s y S c r i p tT MR T R Il 山，共计2 0 I - t l ，4 2 孵育3 0 m i n ，8 5 。C加热5 m i n ，取2 p 1 进行后续扩增。2 3 5 扩增c D N A每个反应体系中含有：逆转录产物2 1 a l ；上游及下游引物各l t x l ；1 0 x E a s y T a qB u f f e r ( 含M g + ) 5 1 x l ；2 5 m Md N T P s 4 I _ t lE a
