《K562细胞诱导分化过程中WT1基因表达及其异构体比例变化的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《K562细胞诱导分化过程中WT1基因表达及其异构体比例变化的研究（34页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山西医科大学硕士学位论文K562细胞诱导分化过程中WT1基因表达及其异构体比例变化的研 究姓名：李晓红申请学位级别：硕士专业：血液内科学指导教师：王宏伟20060508山西医科大学硕士学位论文摘要目的应用荧光定量R T P C R 技术，分析K 5 6 2 细胞株诱导分化过程中W T I 基因及其四种异构体表达水平及比例变化。探讨孵l 基因与细胞分化的关系，进一步阐明t t T 1 基因在造血系统细胞增殖、分化中发挥的作用。方法1 建立荧光定量检测系统。2 培养K 5 6 2 细胞，应用终浓度为1 0 n g m l 佛波酯f 1 2一t e t r a d e c a n o y l p h
2、 o r b 0 1 1 3 一a c e t a t e ，T P A ) 诱导K 5 6 2 细胞分化，并采用N B T ( 硝基四氮唑蓝)还原实验及细胞免疫表型检测判断细胞分化程度。3 实时荧光定量R T - P C R 技术定量检测K 5 6 2 诱导分化过程中总W T l 基因及其1 7 a a + ，K T S + 两类异构体的表达水平，8 - - a c f i n 作为内参照。在此基础上计算出W T l ( + 件) 、W T l ( + ，_ ) 、W T I ( + ) 、W T I ( - ) 四种异构体在细胞分化过程中表达水平及比例的变化。结果1 以阳性标准品进行三条标
3、准曲线的建立，其相关系数均达0 9 9 5 以上。2 随着药物作用时间增加，N B T I j H 性率及C D 9 表达阳性率均明显增加( p 一1 7 ) 的- 8 0 保存待用。3 2 反转录：反应体系为2 0 u1 ，取样品总R N A0 5ug 、随机引物0 4ul ( O 5Hg p1 ) 、自n b E P C 水至1 1 | l1 ，7 0 。C5 分钟后立即冰浴，然后依次加入5 逆转录酶缓冲液2 5 u1 、l O m m o l Ld N T P s2 5 u l 、R N A s i n0 4 u 1 ( 5 0 u u 1 ) ，力I D E P C 水至1 9 u l
4、 ，3 7 5 分钟后冰浴，最后J J I I M M u l v 逆转录酶lpl ( 2 0 0 U ) ，2 5 。C 1 0 分钟、3 7 。C 6 0 分钟、7 0 V1 0 分钟，一2 0 保存。3 3 荧光定量P C R 反应：反应体系2 5 u t ：包括T a q M a nC o r eR e g e a n t s1 2 5 u l ，l O u M引物各2 2 5 u l ，l O u M 探针0 6 2 5 u l ，e D N A 2 u l ，补水至2 5 u l 反应体系。反应条件：5 0 。C2分钟，9 5 。C1 0 分钟；9 5 。C3 0 秒，6 0 3
5、0 秒，4 5 个循环。( G e n e A m p5 7 0 0S e q u e n c eD e t e c t i o nS y s t e m P EA p p l i e dB i o s y s t e m s ) 反应设立内对照D a c t i n 。将W T I 0 一a c t i n 、1 7 a a + B a c t i n 、K T S + B a c t i n 分别作为W T I 基因及1 7 a a + 、K T S + 异构体的相对表达量，以消除R N A 制备及逆转录过程中造成的误差。1 7 a a + 、K T S + 两类异构体及W T l ( +
6、 + ) 、W T l ( + 一) 、W T l ( 一+ ) 、W T l ( 一一) 四种异构体的表达比例计算如下：1 7 a a + 表达比例= 1 7 a a + 总W T lK T S + 表达比例= K T S + 总W T IW T l ( + 十) 表达比例= ( t 7 a a + 总W T l ) X ( K T S + 总W T l )W T l ( + 一) 表达比例= ( 1 7 a a + 总W T I ) X ( 1 一K T S + 总W T l )W T I ( - + ) 表达比例= ( 卜1 7 a a + 总W T I ) X ( K T S + 总W
7、 T l )W T I ( - - ) 表达比例= ( 卜1 7 a a + 总W T l ) x ( 1 一K T S + 总W T l )4 统计学处理应用S P S S l l 5 ( s t a t i s t i c p a c k a g e o f s o c i a ls c i e n c e ) 统计学软件处理数据。符合正态分布的数据采用趸s 表示，应用单因素方差分析各组数据问的差异。均数两两比较采用L S D法。山西医科大学硕士学位论文结果1 阳性标准品的制备及标准曲线的建立1 1阳性标准品的制备以f f 5 6 2 细胞提取的T o t a l R N A 为模板，应用
8、的上游引物与的下游引物扩增8 5 4 7 6 b p片段，电泳结果见图2 。将此片段连接入质粒载体测序，测序结果证实扩增出的片段为所需的阳性产物。测序结果见图3 。5 0 0 b po1 D N Am m k e r2 4 7 6 b p 产物 图2 阳性标准品P C R 电泳图图3阳性标准品测序结果山西医科大学硕士学位论文1 2 标准曲线的建立取稀释为1 0 3 、1 0 4 、1 0 5 、1 0 6 、1 0 7 拷贝数的阳性标准品为模板，分别应用三对引物与探针通过荧光定量R TP C R 方法建立用于检钡, O W T l 、1 7 a a + 、K T S + 表达水平的三条标准曲线
9、。曲线斜率控制在一3 3 左右，相关系数( r ) 5 0 9 9 5 各自标准曲线及扩增曲线见图4 A 、图4 B 、图5 A 、图5 B 、图6 A 、图6 B 。x 轴：起始拷贝数( L o g ) Y 轴：循环闽值( r - O9 9 5 1 图4 Aw T l 标准曲线x 轴：循环闽值Y 轴：荧光强度 图4 BW T l 阳性标准品扩增曲线山西医科大学硕士学位论文X 轴：起始拷贝数( L o g )Y 轴：循环闽值( r = 0 9 9 5 ) 图5 AK T s + 标准曲线x 轴：循环闽值Y 轴：荧光强度 图5 BK T S + 阳性标准品扩增曲线O山西医科大学硕士学位论文。垂t
10、 L 、篱濑i一、 、 翼然 1 震、g 鬻h、纛 j j 纛? j、： 黧 1 ”勰。”冀| | 蘩黪瓣一麟黧褰；疆燃粪蠢x 轴：起始拷贝数( L o g Y 轴：循环闽值( r = O 9 9 8 )图6 A1 7 a a + 标准曲线x 轴：循环阂值Y 轴：荧光强度 图6 B1 7 a a + l j 日性标准品扩增曲线K 5 6 2 细胞未加药时呈悬浮生长，细胞个大，圆且透亮( 见图7 A 、7 B ) 。加入T P A 作用2 4小时后细胞有贴壁生长的趋势( 见图8 A 、8 B ) ，形态不规则，呈梭形，多边形，有伪足。7 2小时药物处理组不规则细胞明显增多，多数细胞贴壁生长( 图
11、8 C ) ，细胞生长曲线显示药物处理2 4 d , 时后细胞增殖与对照组比较明显减慢( 图9 ) 。图7 A 对照组细胞( 2 0 0 倍)图8 A 加药2 4 小时组K 5 6 2 细胞( 4 0 0 倍)图7 B 对照组K 5 6 2 细胞( 4 0 0 倍)图8 B 加药2 4 小时组K 5 6 2 细胞( 4 0 0 倍)山西医科大学硕士学位沧文图8 C 加药7 2 J J , 时组K 5 6 2 细胞( 2 0 0 倍)仁j 孤订 l 二竺堑塑丛塑塑i0 h6 h2 4 h4 8 h7 2 h时问图9 对照组及药物处理组细胞生长曲线3K 5 6 2 1 t 胞经T P A 诱导分化
12、后细胞化学及免疫学变化3 1 N B T 还原试验结果预实验证实对照组各个时间点与药物处理O 小时组没有显著差别，因此所有试验将药物处理0 4 , 时组作为对照，用药物处理后1 2 ，2 4 ，4 8 ，7 2 小时组分别与0 小时组作比较。药物作用不同时间点N B T I j E I 性率见表2 。K 5 6 2 诱导分化前N B T 还原率为l - 3 3 O 5 8 ，药物作用后N B T 还原率逐渐升高。2 4 、4 8 、7 2 小时分别为后为5 3 0 0 1 4 1 1 、7 1 6 7 7 5 l、8 2 0 0 7 0 0 均明显高于药物作用O 小时组( p ( 1 0 -
13、4 7 2 ( n 2 6 ) 4 , 2 2 X1 0 。12 9 X1 0 39 6 【n 2 3 )4 6 4 1 0 “1 5 3 l O - 30 0 0 7“0 0 6jU 0 0 5譬0 0 0 4皿0 0 0 3呈0 0 0 2O 0 0 10O h注：与药物作用0 小时比较有显著性差异+ P O0 52 4 h4 8 h7 2 h9 6 h时间图1 3T P A 诱导 K 5 6 2 分化过程中w T l 基因表达水平的变化64 217 a a + 、K T s 十异构体表达水平及比例的变化同样以0 - - a c t i n 为内参，把1 7 a a + 、K T S +
14、的拷贝数与B - - a c t i n 拷贝数之比作为其相对表达量。结果显示，1 7 a a + 、K T s + 两类异构体表达水平的变化与，营, w r l 的变化趋势一致。2 4 小时表达水平迅速降低，之后表达水平略有升高。T P A 诱导K 5 6 2 细胞诱导分化过程中这两类异构体均出现两次高表达，结果见表5 、图1 4 。表5T P A 诱导K 5 6 2 分化过程中1 7 a a + 、K T s + 异构体表达水平的变化盖 翌 姗 砗 帅注：各组数值后所标识的字母表示该组与字母所示组有显著性差另O p O 0 5时间图1 4T P A 诱导K 5 6 2 分化过程中1 7 a
15、 a + 、K T s + 异构体表达水平的变化1 7 a a + 、K T S + 两类异构体所占总w T l 基因的比例见表6 图1 5 。药物作用0 至9 6 4 , 时之间，两类异构体的比例逐渐下降。1 7 a a + 异构体比例由o d , 时的0 6 0 + 0 1 4 降到9 6 d , 时的0 3 7 0 1 0 。K T S + 异构体比例由0 6 4 0 1 2 降至9 6 d , 时的0 4 1 O 1 4 。与药物处理o d , 时比较7 2小时组及9 6 4 , 时组有显著性差别( p O 0 5 ) 。( 表6 、图1 5 )表6T P A 诱导K 5 6 2 分化
16、过程中1 7 a a + 、K T s + 异构体比例变化注：与药物作用O 小时比较有显著性差异4 P 00 5时间图1 5T P A 诱导K 5 6 2 分化过程中1 7 a a + 、K T S + 异构体比例变化山西医科大学硕士学位论文4 3W T t 四种异构体表达水平及比例的变化W T l ( + + ) 表达水平分化早期就开始下降，加药2 4 J , 时为5 1 3 1 0 1 2 1 2 1 0 1 与加药前1 7 0 1 0 。3 5 6 6 xt 0 1 比较有显著性降低。2 4 ，4 8 ，7 2 ，9 6 小时之间没有差别。W T l ( + )表达水平各组之间没有显著性差别( 数值未显示) 。W T I ( 一+ ) 表达
