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1、金银花有效成分提取工艺的优化研究 陆凤琪，杨硕，胡勃，陈文成， 陆泉，储明明，王延明 指导老师：时维静教授摘要：目的摘要：目的 研究金银花抑菌成分的最佳提取工艺。方法方法 以绿原酸为检测指标，研究了不同的提取方法对绿原酸含量的影响。并结合抑菌试验来综合考虑金银花抗菌成分的最佳提取工艺。结结果果 最佳提取工艺为乙醇回流提取法 关键词：金银花 绿原酸 提取工艺 抑菌活性 Extraction process of Antimicrobial Constituents From Flos LoniceraeAbstract：Objective：To study the optimum extract
2、ing condition of antimicrobial constituents from flos lonicerae. Methods: To determine the chlorogenic acid, the content of Chlorogenic acid was studied the effect of different extracting condition and the antimicrobial abilities by extract. Results: The optimum extracting condition was reflux extra
3、ction with alcoholKey words: flos lonicerae; chlorogenic acid; extraction process; antimicrobial abilities金银花为忍科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.、红腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、或毛花柱忍冬 Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或带初开的花。其中绿原酸为金银花的主要抑菌活性成分，具有清热解毒、抗菌消炎和抗衰老的作用，现代药理研究表明，其还具有保肝利胆、调节免疫、升高白细胞、降血压、降血脂、清除自由基，并对消化
4、道的癌症有明显的抑制作用。绿原酸类化合物是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸，易溶于水，乙醇等溶剂。从金银花中提取绿原酸多采用煎煮法、浸渍法、回流法等，目前在分离绿原酸的方法常采用改良石硫法、水提醇沉法、乙醇热回流法、水提正丁醇萃取法等，但是在那种提纯方法最好，目前国内学者还没有确定的结论，有的人认为乙醇热回流法最好1，并且有人就乙醇热回流提取法进行了深入的研究2 。为了进一步了解那种提取方法对金银花中抑菌成分的提取效果最好，我们分别做了改良石硫法、水提醇沉法、乙醇热回流法、水提正丁醇萃取法，并用不同的提取物来做抑菌试验，结合了提取物中绿原酸的含量来确定金银花抑菌成分的最佳提取工艺。并且就乙醇热回流
5、法做了正交试验，来寻找影响金银花中抑菌成分的提取的因素，为进一步优化金银花乙醇提取工艺提供参考。 1材料和仪器金银花购自安徽亳州药材市场，经安徽科技学院生命科学学院刘汗珍副教授鉴别本品为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的花蕾。绿原酸对照品购自（中国药品生物制品鉴定所） ，其余试剂均为分析纯。供试菌种：枯草芽孢杆菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌；绿脓杆菌。 （由安徽科技学院微生物实验室提供）培养基：细菌用营养琼脂。蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，NaCl 5g，琼脂 15g 葡萄糖5g 水 1000ml，PH 值 7.2。在 121.3灭菌 20min。TU1810 紫
6、外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） ；DHG781 电热恒温培养箱（湖北省黄石市医疗器械厂） ；RE 5298 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂） ；ZDX35 手提式压力蒸汽灭菌器。 2 方法与结果2. 1 绿原酸提取方法的比较常用的中药溶剂提取法有:浸渍法,渗漉法,煎煮法,回流提取法和循环提取法.目前金银花的提取方法主要有水提法,石硫法,水提醇沉法,乙醇回流法等。对各种提取纯化工艺进行比较评价的指标主要有:绿原酸得率,绿原酸提取率和绿原酸含量2.1.1 改良石硫法取金银花 50 克，加 15 倍量的水，浸提（温度不超过 80 度为好，避免破坏绿原酸的成分） 。提取时间为 2 小
7、时，再加水 10 倍量煎煮一个半小时，合并提取液静止 12 小时以后，浓缩至 1：2.5（w/v） ，缓缓加入 20%的石灰乳调 PH 值至 10 左右，离心，沉淀物，加入 2 倍量 95%乙醇研磨成浆，搅拌下滴加 50%硫酸调 PH 至 3 左右，充分搅拌，离心，酸水液用 40%NaOH 调 PH 为 6 左右，回收乙醇，减压烘干，得粗提取物。粗提取物溶于 23 倍量水中，HCL 调 PH 为 2，以乙酸乙酯萃取数次，乙酸乙酯液用活性碳脱色，过滤，滤液浓缩后，分次加入适量的氯仿，滤取固体物，常压干燥，得淡黄色绿原酸固体。2.1.2 水提正丁醇萃取法取金银花 50 克，加 10 倍量的水，80
8、 度浸提 2 次，每次 2 小时，过滤并合并浸液，静止 12 小时，浓缩至比重 1.151.20，浓缩液用 50%硫酸调 PH 值 3 以下，以正丁醇萃取 3 次，合并萃取液，PH 值调为 67，减压回收溶剂，浓缩干燥。称取固体重量。2. 1. 3 乙醇回流乙酸乙酯提取法取 20 克金银花,加 10 倍量的 50%乙醇, 80 度浸提 2 次，每次 1h，合并滤液，减压浓缩，回收乙醇，将浓缩液的 PH 值调至 2 左右，以 4 倍量的乙酸乙酯分 4 次萃取，合并萃取液，用适量水洗涤 2 次，以 40%NaOH 将 PH 值调为 67，分取水层减压浓缩至稠膏，再干燥。2.1.4 水提醇沉法取 2
9、0 克金银花,加 10 倍量的水,80 度浸提 3 次 ,每次 1.5 小时，然后将提取液过滤，滤液减压浓缩至相对密度为 1.121.14（50 度）的浓缩液；加入乙醇，使醇沉C C = = 0 0. .0 03 37 71 1A A + + 0 0. .0 00 09 98 8R R2 2 = = 0 0. .9 99 99 96 60 00 0. .2 20 0. .4 40 0. .6 60 0. .8 81 11 1. .2 21 1. .4 40 01 10 02 20 03 30 04 40 0浓浓度度m mg g/ /L LA Ab bs s浓度达 60%，冷藏 24h，滤过，滤
10、液回收乙醇至尽，减压真空干燥。2.2 绿原酸的定性检验 2.2.1：取提取物 10 毫克，溶解在甲醇溶液中，然后吸取甲醇混匀液在硅胶 H-CMC板上点样，以乙酸乙酯:甲醇:水（7:2.5:2.5）展开，待板干后，在紫外灯下，以 365nm照射，则绿原酸显示蓝色荧光斑点。2. 2. 2: 取提取物 10 毫克，溶解在蒸馏水中。然后取一支试管中加入醋酸和亚硝酸钠溶液，将提取物溶液取 1 毫升加入试管中，绿原酸在醋酸中与亚硝酸钠反应呈亮黄色，再加过量的 NaOH，则颜色转为鲜红色。2.3 绿原酸含量的测定2.3.1 金银花中绿原酸含量的测定供试品溶液制备：精密称取金银花干燥碎品(50干燥 30 mi
11、n)1g,置索氏提取器中,用 60ml 甲醇提取 10 小时.金银花提取液浓缩,定容 50ml.精密吸取金银花甲醇溶液100l 于层析滤纸上点成条形,以正丁醇-醋酸-水(4:1:2)为展开剂展开 14cm,取出晾干后,在紫外光灯下检视,层析结果.剪下绿原酸斑点,置带塞锥形瓶中,精密加入 0.2molL-1盐酸溶液 10ml,在超声波震荡器中放置 12 小时后,将溶液倒入 10ml 的容量瓶中，加0.2molL-1盐酸溶液置刻度，即得供试品溶液3。2.3.2 提取物中绿原酸含量的测定供试品溶液制备：精密称取 4 组提取物粉末 2.0mg，在小烧杯中加蒸馏水溶解，然后移液至 50ml 的容量瓶中，
12、加蒸馏水至刻度，即得供试品溶液。2.4 对照品溶液的制备：精密称取绿原酸标准品 1.88mg，加蒸馏水溶解并定容至50ml 容量瓶中，即得 0.0376mgml-1的对照品溶液。2.4.1 标准曲线的制备：分别取对照品溶液 0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、9.0ml 于 10ml容量瓶中，摇匀，静置 15min，进行全波长扫描，在 325nm 处均有最大吸收。以该波长处吸光值为纵坐标，样品质量浓度（mgL-1）为横坐标，得标准曲线回归方程为 C = 0.0371A + 0.0098，相关系数 r=0.9997。如图 1。图 1 样品标准曲线2.5 样品测定：精密吸取供试品溶液 1.0m
13、l，以法测定吸光度，按回归方程计算绿原酸的质量分数。2.6 抑菌活性的测定：采用平板法。取各种供试菌悬液各 0.2ml，分别注入无菌培养皿内，再倒入 15ml 琼脂培养基，混匀后冷却成含菌平板。然后将每个平板均分成 4 等份，每份正中处轻放一无菌牛津小杯，在牛津小杯中注入浓度为 30%的金银花提取物的水溶液，每菌作 3 次重复，然后将培养皿放置培养箱中 36培养 24h，测量每个牛津小杯所对应的抑菌圈直径大小，抑菌圈越大，抑菌活性越好。3.3 不同提取方法结果比较3.3.1 不同提取物中绿原酸含量的比较表 2 金银花不同提取方法结果比较改良石硫法水提正丁醇萃取法乙醇回流提取法水提醇沉法绿原酸提
14、取率（%）11.40418.08937.49794.681绿原酸质量分数（%）68.87242.83494.32616.685由表 2 可知，以绿原酸提取率为考察对象，水提醇沉法的结果最高，乙醇回流乙酸乙酯提取法次之；而以绿原酸质量分数为考察对象，乙醇回流乙酸乙酯提取法最高，改良石硫发次之。然而改良石硫法，水提正丁醇萃取法和水提醇沉法都是水提的，但是结果却相差甚大，说明在提纯方法上，改良石硫法的提纯工艺是三者之中最好的。但是相比较乙醇回流乙酸乙酯提取法的提纯工艺还是后者比较好。3.3.2不同方法提取物的抑菌比较 表 3 抑菌活性的比较( ，=4)提 取方 法改良石硫法水提正丁醇萃取法乙醇回流提
15、取法水提醇沉法枯草芽孢杆菌2.410.0352.090.0202.410.0361.900.031金黄色葡萄球菌2.610.0252.220.0252.420.0311.830.021大肠杆菌3.470.0422.600.0352.400.0202.200.035绿脓杆菌2.720.0492.250.0502.630.0251.910.031由表 3 可知，在对 4 种不同致病菌的抑菌比较中，改良石硫法所得到的提取物抑菌效果最好，其次是乙醇回流法得到的提取物抑菌效果好。这与二者之间的绿原酸质量分数比较成反比关系。这可能是因为，改良石硫法在提取绿原酸的同时也提取出其他成分，这些成分与绿原酸相互协
16、同产生很好的抑菌效果。而乙醇回流法所得到的提取物中绿原酸质量分数最高，同时其他产物的质量分数就相对很低，其抑菌效果就相对较低一些。就提取物中绿原酸的质量分数而言，乙醇回流法要比改良石硫法多出 30%多，而他们的抑菌效果相比较而言，基本上相差不大。 就综合来说，还是选用乙醇回流法比较好。3 3 讨论讨论在比较不同的提取方法对绿原酸的含量影响，其中以乙醇回流法所得到的提取物中绿原酸质量分数最高，达到 94.326%；水提醇沉法虽然得到的绿原酸提取率最高，但是其所含的杂质也相对较高，提取物中绿原酸的质量分数只有 16.685%。在比较不同的提取物的抑菌效果时，以改良石硫法所得到的提取物抑菌效果最好，其次是乙醇回流提取法所得到的提取物抑菌效果好。我们知道金银花中的抑菌成分主要就是绿原酸，但是在抑菌效果上并没有因为绿原酸的质量分数高，其抑菌效果就好。就像在我们研究中药中出现的情况，中药中单体成分的药用效果并没有整体的效
