克伦特罗说明书一步法

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1、2010-01 版1盐盐酸克酸克伦伦特特罗酶联罗酶联免疫免疫检测试剂检测试剂盒使用盒使用说说明明书书一、概要一、概要克伦特罗（clenbterol，CLE）是一种肾上腺受体激动剂，此类药品在临床上用于治疗支气管哮喘、慢性支气管炎和肺气肿等疾病。因为该药可以提高瘦肉率，减少脂肪沉积和促进动物生长，被一些畜牧养殖企业作为养殖促进剂非法使用。人食用了饲喂克伦特罗作为添加剂的动物所产生的畜产品后，残留的克伦特罗可导致人体肌肉震颤、心悸、神经过敏、头痛、目眩、恶心、呕吐、发烧、战栗等症状，对消费者的健康造成极大危害。我国农业部第 235 号文件规定不得检出。本试剂盒是应用 ELISA 技术研发的药物残留

2、检测产品,与仪器分析技术比较，能经济、快速地检测出尿样、肌肉、肝脏及饲料等中的克伦特罗。二、测定原理二、测定原理本试剂盒是利用竞争 ELISA 方法，在酶标板微孔上预包被抗克伦特罗抗体。检测时，加入标准品或样品溶液及克伦特罗酶结合物，他们竞争性地与克伦特罗抗体结合，形成抗原抗体复合物；用 TMB 底物显色；加入反应终止液后在 450nm 波长酶标仪下进行检测，样品中的克伦特罗浓度与吸收光强度成反比。 三、试剂盒组成三、试剂盒组成酶标板 1 块(包被抗克伦特罗抗体) 标准液 6 瓶（1ml/瓶）：0、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb。酶结合物 7ml显色剂 A

3、 7ml显色剂 B 7ml终止液 7ml10浓缩洗涤液50ml 说明书 1 份四、需要但试剂盒中不提供的器材和试剂四、需要但试剂盒中不提供的器材和试剂（1）设备微孔板酶标仪(450nm)振荡器离心机微量移液器：20l200l,100l1000l容量瓶：100ml，500ml，1000ml（2）试剂三氯乙酸氢氧化钠叔丁基甲醚 色谱级浓 HCl氯仿磷酸Tris 乙酸乙酯乙腈五、样本前处理步骤五、样本前处理步骤样本处理前须知样本处理前须知处理任何样本时，都须注意：（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干

4、扰实验结果。样本前处理需配制样本前处理需配制： 配液 1：3%的三氯乙酸溶液 称 3.0g 三氯乙酸加去离子水溶解定容至 100ml。 配液 2：1M 盐酸溶液 量取 8.6ml 浓盐酸加去离子水混匀定容至 100ml。 配液 3：1M 氢氧化钠溶液 称 4.0gNaOH 加去离子水混匀溶解，定容至 100ml。 配液 4：0.05M 的盐酸溶液 取 0.43ml 的浓盐酸加去离子水混匀溶解，定容至 100ml。或者从 1M 的盐酸溶液中取 5ml，然后加入 去离子水定容至 100ml。 配液 5：0.09M 的 Tris 称 1.09g 的 Tris 加去离子水混匀溶解，定容至 100ml。

5、样本处理步骤样本处理步骤：（1）尿样 尿样直接测定，若尿样呈浑浊状，4000 转分钟离心 10 分钟后取上清部分（清亮部分）用于检测。 注：稀释倍数为倍。 （2）带有低脂肪的肝、肉或组织 a)2g 匀浆的样品与 10ml 3%的三氯乙酸 （见配液 1）在 50ml 聚苯乙烯离心管中混合，振荡 10 分钟。 b)3000 转离心 5 分钟。取上清。 c)用 1M 的 NaOH（见配液 3）调节上清 pH 值至 911 间。 （约加入 1.5ml1M NaOH 溶液） d)加 10ml 叔丁基甲醚，振荡混匀。3000 转/分离心 5 分钟。e)取 5ml 上清，在 50-60水浴用氮气吹干。 f)

6、用 0.5ml 0.05M（见配液 4）盐酸溶解干燥的残留物，再 加 0.5ml 0.09M Tris（见配液 5）中和。取 50l 进行分 析。 注：稀释倍数为倍。 （3）高脂肪肉和组织2010-01 版2a) 3g 匀浆的样品与 7.5ml 3%的三氯乙酸（见配液 1）在 50ml 聚苯乙烯离心管中混合，振荡 10 分钟。 b) 加入 10ml 氯仿，震荡混匀，3000 转/分离心 5 分钟。 c) 取上清 5ml，并用 1M 的 NaOH（见配液 3）调节上清 PH 值至 911 间。 （约加入 0.7ml1MNaOH） d) 加0ml 叔丁基甲醚，震荡混匀。3000 转离心 5 分钟。

7、 e) 取 5ml 的上清，在 50-60水浴用氮气吹干。 f) 先用 0.5ml 0.05M（见配液 4）盐酸溶解干燥的残留物， 再加 0.5 ml 0.09M Tris（见配液 5）中和。取 50l 进行分 析。 注：稀释倍数为倍。（4）饲料样品处理方法1）配合饲料样品处理方法 a) 用食品粉碎机或乳钵研碎饲料样品，称 2.0g 研碎的饲料 样品，加入 2ml 1M HCl（见配液 2） ，加入 16ml 双蒸水混 匀。 b) 放振荡器上振荡 15 分钟。 c) 4000rpm 离心 10 分钟,取 1ml 上清用 1M NaOH 调 pH 值 至 7.08.0 之间。 d) 将调好 pH

8、 值的液体 10000 转离心 5 分钟。 e) 取 30l 上清液用试剂盒进行分析， 注：样本稀释倍数为 10。 若样品超出检测范围很多，而欲定量，可再进行稀释至 100 倍。 2）预混饲料样品处理方法a) 称取 1.5g 匀质样品于 15ml 离心管中，加入 8ml 乙腈，1ml 乙酸乙酯充分混匀,室温 4000 转离心 5min；b) 移取 6ml 上清到另一离心管中， ，60-70氮气吹干；c) 1 ml 正己烷溶解干燥物，加入 1ml 0.1MPBS,漩涡振荡1min,3000 转离心 3min；d) 取 50l 下层用于分析。注：样本稀释倍数为 1注：样品制备已完成，进行定量分析，

9、应考虑到样品中可能含 有克伦特罗的浓度。如超出范围需用双蒸水稀释至试剂盒的可 测定范围之内，再使用试剂盒进行分析。六、酶联免疫测定程序六、酶联免疫测定程序测定前须知：1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。2、使用之后立即将所有试剂放回 2-8。3、在使用中不要让微孔干燥。4、在 ELISA 分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用该板膜盖住微孔板。测定步骤：1、将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡 30min 以上，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做 2 个平行试验。2、配液 A：

10、将 50ml 浓缩洗涤液（10 倍浓缩）用蒸馏水稀释至 500ml 备用。 （可按需配置）3、加标准液或样品液 50l 到相应的微孔中，然后加 50l酶结合物到微孔板中，用膜盖好， 26下避光反应 30分钟。4、小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（即配液 A）300l/孔，充分洗涤 45 次，每次间隔 10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破） 。5、显色剂 A 和 B 以 1：1 充分混合后，加 100l 到微孔中，并在 26下避光反应 15 分钟。6、加 50l 终止液到微孔板中，在酶标仪于 450nm 处测定OD 值。七、结果七、结果所测得的标准液和样品

11、吸光度的平均值除以第一个标准液（0 标准液）的吸光度值再乘以 100，得到百分吸光度值。0 标准液的百分吸光度值等于 100%。标准液的吸光度值（或样品）-100 = %吸光度值0 标准液的吸光度值以标准品浓度的以 10 为底的对数为 X 轴， 百分吸光值为 Y 轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为 10 的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含克伦特罗的量。八、检测方法灵敏度、准确度、精密度八、检测方法灵敏度、准确度、精密度试剂盒灵敏度试剂盒灵敏度：0.1PPb样本最低检测限：样本最低检测限：尿样 0.1ppb肝/肉样1ppb配合饲料 5 ppb预

12、混饲料1 ppb准确度：准确度：尿样 9515%肝/肉样7515%饲料 10020%精密度精密度：试剂盒的变异系数均小于 10%九、特异性九、特异性与类似物的交叉反应率：克伦特罗100%特布他林0.1%沙丁胺醇0.1%盐酸肾上腺素0.1%去甲肾上腺素0.1%2010-01 版3莱克多巴胺0.1%福英特罗0.1%多巴酚丁胺0.1%沙美特罗0.1%盐酸麻黄碱 0.1%十、注意事项十、注意事项1、室温低于 20或试剂及样本没有回到室温（20-25）会导致所有标准的 OD 值偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3

13、、每加一种试剂前需要将其摇匀。4、反应终止液为 2M 硫酸，避免接触皮肤。如不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于 2-8，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450nm）值小于 0.6（A450nm0.6 ）时，表示试剂可能变质。8、在加入显色剂后，一般显色 15min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 20min（或更长） ，但不得超过 30min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为该试剂盒最佳反应温度为 26，温度过高或过低将导致，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。检测吸光度值和灵敏度发生变化。十一、贮藏条件及保存期十一、贮藏条件及保存期贮藏条件：在 28保存试剂盒保存期：本试剂盒有效期为 12 个月。提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然 正常有效，不影响实验结果，请放心使用。正常有效，不影响实验结果，请放心使用。