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1、2 0 0 5 年( 第四届) 中国纳米科技西安研讨会论文集 2 0 0 5m e4 hC h i n e s eS y m p o s i u mo nN a n o s e i d a c e & T e c h n o l o g y基因纳米粒子抑制移植静脉再狭窄的实验研究杨菁1 宋存先1 郎晓讴2( 1 中国协和医科大学、中国医学科学院生物医学工程研究所天津市生物材料重点实验室，天津3 0 0 1 9 2 )( 2 中国医科大学第一临床医院觑管外科，沈阳11 0 0 0 1 )摘要：目的：制备包载p 2 7 k i p l 基因的纳米粒子并进行体外表征，用大鼠自体静脉移植试验观察p 2
2、 7 k i p l 基因纳米粒子对移植静脉内膜增生的抑制作用。方法：用F D A 批准的生物可降解材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物( P L G A ) 为载体材料，制备载p 2 7 k i p l 基因的纳米级微粒。用激光光散射法测定纳米粒子的粒径及粒径分布，扫描电镜观察纳米粒子表面形态，体外观察p 2 7 k i p l 基因从纳米粒子中的释放。体外转染大鼠血管平滑肌细胞，用流式细胞仪分析p 2 7 k i p l 基因纳米粒子对细胞周期的影响作用。建立自体静脉移植大鼠模型，随机分成三组进行试验：p 2 7 k i p l 基因纳米粒子组，空白纳米粒子组，单纯静脉移植组。分别于给药后3 天、7
3、天、1 4 天、2 8 夭取材，H E 染色及V e r h o e f f 染色检测内膜厚度，W e s t e r nb l o t 检测P 2 7 抑癌基因蛋白的表达，免疫组化S A B C 法检测移植静脉内膜P C N A 、E 2 F 表达。结果：p 2 7 k i p l基因纳米粒子的平均粒径为2 8 8 9 n m ，呈窄分布，粒子表面光滑，D N A 含量为3 。包封效率为8 6 。D N A 体外最初释放速度较大，约1 周后释放速度开始减缓，可维持平稳释放1 5 天以上。p 2 7 k i p l 基因纳米粒子组在大鼠血管平滑肌细胞中进行细胞转染，p 2 7 k i p l
4、蛋白表达3 天、7 天、1 4 天较其他两组明显增多( P O 0 5 ) ；7 天、1 4 天、2 8 天，基因治疗组的内膜平均厚度明显低于对照组( p 0 0 5 ) 。对照组与单纯静脉移植组无显著性差异，结果见图4 。结果表明基因治疗组明显减轻了内膜的增生程度，抑制了平滑肌细胞的增殖。矽燃撼的o性簟v藿寒2 0 0 5 年( 第四届) 中嗣纳米科技西安研讨会论文集 2 0 0 5t h e4 hC h i n e s eS y m p o s i u mO RN a n o s c i e n c e & T e c h n o l o g yI I I I时间( 天)图4 移植静脉血管
5、内膜厚度的形态学测定结果3 4 移植静脉免疫组化观察P C N A 以及E 2 F 的实验结果P C N A 是近年来引人注意的一种与细胞增殖周期有关，参与D N A 合成的核蛋白，检测P C N A 可客观反映细胞增殖特性，P C N A 蛋白表达阳性率高说明细胞处于高增殖状态。P C N A 检测结果显示：术后3 天可以观察到P C N A 蟹囱阳性表达，7 天明显增高，1 4 天达到高峰，2 8 天有所下降。P 2 7 k i p l 基因治疗组r7 天、1 4 天、2 8 天的P C N A 蛋白表达阳性率较对照组明显低，具有统计学显著差异( p 0 0 1 ) 。表明P C N A
6、蛋白阳性表达受到p 2 7 k i p l 臻闪纳米粒子的明显抑制。对照组与单纯静脉移植组之问无显著差异。结果见图5 。视网膜母细胞瘤易感基因R b 蛋白产物磷酸化后会失去抑制转录因二fE 2 F 的作用，而E 2 F 作为转录因n 鳓 动D N A 合成，使细胞从G l 期进入S 期。G l 期的启动是细胞周期的关键，E 2 F 的减少可以抑制细胞从G ，期进入S 期，从而抑制内膜的增殖。p 2 7 k i p l 可以通过阻止R b 蛋白磷酸化来控制细胞周期的进程，检测E 2 F 结果显示：术后3 天可以观察到阳性表达，7 天明显增高，1 4 天后有所F 降。P 2 7 k i p l 基
7、因组较对照组于7 天、1 4 天E 2 F 阳性表达受到明显抑制，( p O 0 5 ) 。对照组与单纯静脉移植组无显著差异。本实验中p 2 7 K i p l 的表达，使静脉平滑肌细胞的增殖受剑明显的抑制，同时也减少了组织中E 2 F 的含量，结果见图6 。4 结论时间( 天)”图5 移植后P C N A 阳性细胞百分比( )图6 移植后E 2 F 细胞百分比( )纳米粒子是一种新兴的基因载体，本实验所用的P L G A 纳米粒子具有很好的组织相容性，在人体内最终代澍产物为H 2 0 和C 0 2 ，无任何毒性，采用双重乳化：【艺包载基因已成功地包载了许多药物和生物大分子f 3 。4 l 。
8、被包裹的寡聚核二舒酸可以免受水解酶的降解，提高了寡聚核苷酸的稳定性，透过血管内皮问隙进入缸管平滑肌细胞，使綦网在细胞内或周围组织中贮存和释放，起到治疗作用。具有一些病毒载体不具备的优势【5 j 。我们的实验证实，应j ；f j 纳水技术包囊p 2 7 k i p I 基因在动物模型上经由移植静脉血管进行基闽转染后，i 】成功地榆f 9 1 i j 5 , 1 p 2 7 k i p l 蛋盹动物模型试验r 1 转培阕组内膜平均厚度较其它组明显减少，3 天、7 天，1 4 天、2 8 天内膜分别为6 8m 、1 5 9m 、1 7 8m 、1 4 3m ( P 0 0 l 、：转纂因组P C N
9、 A 的表达较对照组及单纯静脉移植缃明显降低，3 天、7 天、1 4 人、2 8 犬分别为1 0 2 、2 6 ，J ，4J 5 、毋妙鳃焘。巷叠一一q 。小2 0 0 5 年( 第四届) 中田纳米科技西安研讨会论文集 2 0 0 5t h e4 岫C h i n u eS y m t 嘲l - = o nN a n o s c i e n c e & T e c h n o l o g y 一Il l lI 墨2 4 6 ( p 0 0 1 ) ，；转基因组E 2 F 的表达7 天1 4 天较对照组及单纯静脉移植显著降低( P O 0 1 ) ，3 天、7 天、1 4 天、2 8 天分别为9
10、 6 、1 0 3 ，9 1 、8 7 。结果说明纳米粒子作为基因载体，有效可行，这为基因治疗提供了一个新的途径。参考文献： 1 】杨菁，孙洪范，宋存先等提高载基因纳米粒子包埋率的实验研究生物医学工程学杂志，2 0 0 2 ，1 9 ( 2 ) ：1 0 9 1 1 0 【2 】H a s h i y aN ，A o k iM ，T a c h i b a n aK ，e ta 1 L o c a ld e l i v e r yo fE 2 Fd e c o yo l i g o d e o x y n u c l e o t i d e su s i n gu l t r a s o u
11、n dw i t hr n i c r o b u b b l ea g e n t ( O p t i s o n ) i n h i b i t si n t i m a lh y p e r p l a s i aa f t e rb a l l o o ni n j u r yi nr a tc a r o t i da r t e r ym o d e l B i o c h e mB i o p h y sR e sC o r n r n u n ，2 0 0 4 ，3 1 7 ( 2 ) ：5 0 8 - 1 4 ( 3 】曾勇，朱文玲，王宗立，等纳米粒子栽反义单核细胞趋化蛋白1
12、 基因局部定位转染抑制兔颈动脉内膜损伤后内膜增生的研究中华心血管病杂志，2 0 0 2 ，3 0 ( 2 ) ：6 7 7 0 4 】S o n gC X ，L a b h a s e t w a rV ，S h e b u s kI L l ，L e v yR J ：F o r m u l a t i o na n dC h a r a c t e r i z a t i o no fB i o d e g r a d a b l eN a n o p a r t i c l e sf o rI n t r a v a s c u l a rL o c a ld r u gD e l i v
13、 e r y J o u r n a lo f C o n t r o l l e dR e l e a s e ，1 9 9 7 ，4 3 ：1 9 7 - 2 1 2 【5 】M a oH Q ，R o yK ，T r o u gL e V Le ta 1 C h i t o s a n - D N An a n o p a r t i c l e sa sg e n ec a r r i e r s ：S y n t h e s i sc h a r a c t e r i z a t i o na n dt r a s f e c t i o ne f f i c i e n c y
14、C o n t r o lR e l ，2 0 0 1 ，7 0 ( 2 ) ：3 9 9 - 4 , 2 1 G e n e l o a d i n gn a n o p a r t i c l e sf o rt h ei n h i b i t i o no fr e s t e n o s i si nm i c ev e i ng r a f t i n gm o d e l Y A N GJ l n 9 1S O N GC u r l - f l a i l lL A N GX l a o - O u 2( 1 I n s t i t u t eo f B i o m e d i
15、c a lE n g i n e e r i n g ，C h i n e s eA c a d e m yo f M e d i c a lS c i e n c e ，T i a n j i n3 0 0 1 9 2C h i n a )( 2 D e p a r t m e n to fV e s c u l a rS u r g e r y ，C h i n e s eM e d i c a lU n i v e r s i t y & F i r s tC l i n i c a lH o s p i t a l ，S h e n y a n g11 0 0 0C h i n a )
16、A b s t r a c t ：O b j e c t i v e ：T op r e p a r e dp 2 7 k i p lg e n en a n o p a r t i c l e s ( N P s ) a n do b s e r v e dt h e i n h i b i t i v ee f f e c to ni n t i m a ls m o o t hm u s c l ec e l lp r o l i f e r a t i o ni nm i c ev e i ng r a f t i n gm o d e l 。M e t h o d ：At h e r a p e u t i cg e n e - p 2 7 k i p lw a se n c a p s u l a t e di n t op o l y( 1
