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1、博士生资格考试综述（2005 年 10 月 24 日）泛素化对泛素化对 EGFR 信号调节的研究进展信号调节的研究进展靳彩宁 北京大学基础医学院免疫学系分子免疫实验室 北京大学人类疾病基因研究中心摘摘 要要表皮生长因子受体（EGFR）对于机体正常或病理的过程都具有十分重要的意义。EGFR 受到其配体表皮生长因子（EGF）的刺激后活化，EGF-EGFR 的复合物内化进入细胞，经早期内体、晚期内体和多胞体（MVB），最后到达溶酶体，被溶酶体酶降解。泛素化连接酶 Cb1 可以使活化的 EGFR 单泛素化，泛素化修饰的EGFR 可被内体膜上的分选系统所识别，从而将 EGF-EGFR 的复合物分选到多胞
2、体内部的膜泡上，当多胞体与溶酶体融合时，EGF-EGFR 便进入溶酶体内。在EGF-EGFR 进入多胞体之前，其所带的泛素分子被蛋白体酶切下来被再利用。泛素化修饰对 EGFR 从细胞膜表面内化的意义目前存在争议。一种观点认为，Cb1在 EGFR 和 CIN85(Cbl-interacting protein of 85 kDa )-endophilin 之间起了一个桥梁的作用，Cb1 介导的泛素化为 EGFR 内化所必需；另一种观点认为，dominant-negative Cbl 突变能够阻止 EGFR 的下调，但并不影响 EGF-EGFR 复合物的内化作用，因此，Cb1 介导的泛素化在内化的
3、初始阶段并不起重要作用。关键词：关键词： EGFR 泛素化泛素化 Cb1 众所周知，表皮生长因子受体家族的成员无论对于组织的分化，创伤愈合等机体正常的生理过程，还是一些病理的过程如肿瘤 发生、发展及预后等都是非常重要的。表皮生长因子受体家族是由四种结构和功能相似的生长因子受体组成：EGFR 或人类 EGF 相关受体（HER）-1（ErbB-1）、HER2（neu 或 ErbB-2）、HER3（ErbB-3）和 HER4（ErbB-4）。这四个成员都具有酪氨酸激酶活性。正常情况下，受体都是以无活性的单体形式存在，当与其相应的配体结合后，受体分子之间会形成同源或异源二聚体，两个受体胞内段的酪氨酸激
4、酶彼此作用而相互磷酸化，并启动细胞内的级联信号通路，从而引起细胞一系列形态学的改变。其中表皮生长因子受体（EGFR）是由原癌基因 c-(erbB)-2 编码的分子量为 170kd 的跨膜糖蛋白，由三个功能不同的结构域组成：连接配体的胞外区（与不同的 EGF 相关性生长因子连接）， 跨膜区（将受体固定在细胞膜上）和细胞内的酪氨酸激酶区（激活细胞内的反应级联）。EGFR 具有几种不同的配体，其中最重要的是 EGF和转化生长因子（TGF）-。在静息的情况下，EGFR 集聚在膜表面类似 caveolae的膜性结构中，当受到配体的刺激时，caveolae 中的受体转位到另一特殊的膜性结构，通过 clat
5、hrin 介导的途径内化。当 EGFR 与 EGF 结合后，EGF-EGFR 复合物内化进入细胞，经早期内体、晚期内体到溶酶体进行降解，从而弱化 EGFR 介导的信号。而 TGF- 与 EGFR 结合形成的复合物内化进入晚期内体后，由于 PH 值的下降会使配体与受体解离，绝大部分 EGFR 循环回细胞表面再利用 1，因此，TGF- 具有比 EGF 更强大的丝裂原的潜能，能有效地刺激细胞的扩增。 EGFR 在其配体 EGF 的刺激下活化后可启动一系列下游的信号通路，包括PLC、PI3K、小的 G 蛋白、P21ras、rasGTP 酶激活蛋白(GAP)、生长因子受体结合蛋白 2 (grb2) 和
6、src 激酶家族等。其中研究较明确的主要有两条途径: 一条是 ras-raf-MEK-erk/MAPK 途径, 信号经 shc、grb2 传递, 最后经 c-jun、c-fos 传到核内, 激活 AP-1, 现已发现该途径与增殖激活有关2; 另一条是 PI3K-PKC-IKK 途径, 使IB 磷酸化后导致 NFB 移位至核内, 而将信息传递入核, 该途径与细胞移动性的增强有关3。EGF 刺激产生的信号通路可以受到不同水平的调节，其中包括配体诱导的 EGFR 的二聚花4、活化的受体及其配体向特化的膜区的聚集5、受体在细胞内的分选和降解等6。 本文就对泛素化对 EGF 诱导产生的 EGFR 信号的
7、调节做一总结。 活化的 EGFR 的泛素化及其在溶酶体的降解对 EGFR 介导的信号转导通路具有很重要的调节作用。泛素是一在进化上非常保守的蛋白质，能够共价连接于另一蛋白质分子上，即称为该蛋白被泛素化。在泛素激活酶 1（E1）、泛素偶联酶2（E2）和泛素连接酶 3（E3）的作用下，在泛素 C 末端甘氨酸（Gly-76）和目的蛋白赖氨酸的 -氨基之间形成共价连接。E3 连接酶能够识别底物，决定了泛素化的特异性。通常，单个的泛素分子连接到目的蛋白的一个或几个赖氨酸残基上，称为单泛素化或多个单泛素化7，而单个的泛素分子重复串联在一个赖氨酸残基上，称为多泛素化7, 8。蛋白质泛素化修饰的类型决定了蛋白
8、质的命运。一般单泛素化的蛋白质与质膜蛋白质的内化和组蛋白的调节等有关，而由四个以上泛素分子串联形成的多泛素化是蛋白酶体降解的识别信号。泛素化过程参与了配体诱导的 EGFR 的下调作用。泛素连接酶 Cb1 能够与活化的 EGFR 直接或间接地结合， 调节 EGFR 在溶酶体的降解过程。Cb1-EGFR 直接的相互作用是由 Cb1 分子 N 末端的酪氨酸激酶结合区与 EGFR 第 1045 位磷酸化的酪氨酸结合 9，而它们之间间接的相互作用是由 Grb2 所介导， Grb2 的 SH3 区可以与 Cb1 的脯氨酸富集区结合，而 Grb2 的 SH2 区可以与自身磷酸化的 EGFR相结合10。Cb1
9、 的 RING 指区招募泛素偶联酶 E2，从而 Cb1 作为泛素连接酶，使活化的 EGFR 泛素化11。目前较为公认的观点是，Cb1 介导的 EGFR 的 单泛素化是活化的 EGFR 在溶酶体降解所必需，但泛素化在 EGFR 内化进入细胞的作用存在两种不同的机制。一种机制认为，泛素连接酶 Cb1 介导的 EGFR 的单泛素化发生在质膜，泛素化为EGFR 提供了内化和降解的信号12。另外，Cb1 分子可以通过其 C 末端的脯氨酸-精氨酸基序与接头分子 CIN85 的 SH3 区结合而使其单泛素化13，而 CIN85 的脯氨酸富集区与 endophilin 组成性的结合在一起，endophilin
10、 为参与 clathrin 内化的调节分子，能与脂质双层结合，引起膜局部皱缩，也可以招募其它辅助分子如dynamin, synaptojanin 和 amphiphysin 等，共同参与 clathrin 包被泡的形成。SH3 区的缺失突变体 CIN85 丧失了促进 EGFR 内化的能力，因此认为，Cb1 在 EGFR 和CIN85-endophilin 之间起了一个桥梁的作用14，Cb1 介导的泛素化为 EGFR 内化所必需。另一种机制认为，Cb1 介导的受体的泛素化在 EGFR 内化过程中并不起重要作用15。dominant-negative Cbl 突变能够阻止 EGFR 的下调，但并不
11、影响 EGF-EGFR 复合物的内化 16，这一结果支持 Cb1 介导的泛素化在内化的初始阶段并不起重要作用，而是作用于比较晚的阶段。EGFR 受体胞浆区的 YXX 基序和D/EXXXLL 基序能够被接头蛋白 AP-2 的 2亚单位所识别，使活化的 EGFR 通过clathrin 进行内化17。EGFR 的单泛素化也可以作为其内化的信号12。突变分析的结果表明，这些参与 EGFR 内化的基序或泛素化信号并非 EGFR 内化所必需，突变掉其中任何一个都不会影响 EGFR 的内化，因而推断， EGFR 内化的调节对EGFR 介导信号通路具有至关重要的意义，因而机体进化了多个冗余的信号以确保EGFR
12、 的正确内化。泛素化修饰是 EGFR 从早期内体有效分选到晚期内体/溶酶体进行降解的必需信号。泛素化的 EGFR 首先必须分选进入多胞体（MVB）内部的膜泡18。在酵母中的研究发现，位于内体膜上的三个复合体 ESCRT-I、ESCRT-II 和 ESCRT-III（endosomal complexes required for transport）参与了泛素化受体在内体的分选过程。ESCRT-I 由三个亚单位 Vps23(vacuolar protein sorting)、Vps28 和 Vps37 组成，其中 Vps23 可以与泛素化的受体结合。ESCRT-II 也由三个亚单位 Vps22
13、、Vps25和 Vps36 组成， Vps36 亚单位也可以通过其 NZF（Np14 zinc finger）区与泛素化的分子结合19。因此，哺乳类 ESCRT 蛋白也可以识别泛素化的 EGFR，并参与将其分选到溶酶体进行降解。说到泛素化，我们一定会想到蛋白酶体的作用。蛋白酶体在泛素化的 EGFR的降解过程中起怎样的作用呢？由于活化的 EGFR 在泛素连接酶 Cb1 的作用下 被多个单泛素化(monoubiquitination)，而不是被多泛素化（polyubiquitination）12, 20，因此泛素化的 EGFR 并不会到蛋白酶体被降解，但蛋白酶体可以辅助 EGFR 到溶酶体的分选过
14、程。在早期内体，EGFR 的泛素化修饰是其被分选进入多胞体内部膜泡的信号，当泛素化的信号被内体膜的分选机制所识别之后，蛋白酶体会使泛素分子从被修饰的受体分子上掉下来再利用，而无泛素修饰的受体则被分选到多胞体内部的膜泡21，以利于溶酶体的降解。但蛋白酶体的去泛素化过程并非 EGFR 分选所必需，用 lactacystin 特异地抑制蛋白酶体的活性，泛素化的 EGFR 也能够进行正常的分选，但其从多胞体外膜分选进入内部膜泡的效率显著下降。就游离的泛素分子的再利用而言，蛋白酶体的去泛素化可以使泛素分子免遭溶酶体酶的降解，以确保细胞内有足够的游离泛素分子以进行蛋白质的泛素化过程。保持细胞内泛素分子循环
15、池的稳定性可能是蛋白酶体去泛素化的核心。在酵母中的研究也支持这一点。蛋白酶体相关的去泛素化酶 Doa4 能够使泛素化的蛋白质在被分选进入内部膜泡之前去泛素化，doa4 的删除突变株胞内游离的泛素分子减少，因而导致蛋白质的泛素化程度降低，蛋白质的分选过程也受到影响22, 23。若在此突变株瞬时转染泛素以补充胞内游离的泛素分子池，则蛋白质可进行正常的分选和降解24。综上所述，泛素化修饰在调节 EGFR 的信号方面具有十分重要的意义，但具体的机制还有待进一步研究。文献:1. Alan Wells. (1999). Molecular in focus: EGF receptor. The Inter
16、national Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31, 637-643.2. Bergstrom JD, Westermark B, Heldin NE. (2000). Epidermal growth factor receptor signaling activates met in human anaplastic thyroid carcinoma cells. Exp Cell Res. 259(1) , 293-9.3. Turner NA, Ball SG, Balmforth AJ. (2001). The mechanism of angiotensin II-induced extracellular signal-regulated kinase-1/2 activation is independent of angi
