《HIFα及VEGF在类风湿关炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HIFα及VEGF在类风湿关炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、HIF-1HIF-1 及及 VEGFVEGF 在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义达及意义【摘要】目的目的 对 HIF-1 及 VEGF 在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达及意义进行 探讨。方法方法 对我院收治的类风湿关节炎患者 18 例进行回顾性分析。将上述患者分为 A、B、C 三组，A 组培养条件为正常供氧；B 组培养条件为缺氧 6 小时；C 组培养条件为缺 氧 12 小时。培养完毕后分别对三组的 HIF-1 及 VEGF 表达情况进行测定，并将各组结果 进行对比。结果结果 A 组 HIF-1 表达水平为 0.16590.0341，VEGF
2、表达水平为 0.04490.0003；B 组 HIF-1 表达水平为 0.75410.0071，VEGF 表达水平为 0.52290.0161；C 组 HIF-1 表达水平为 1.13050.0304，表达水平为 0.62710.0081，以上各组比较差异存在统计学意义（P0.05）,具有可比性。 1.2 方法 对以上患者先进行取样并将样本置于离心管中，离心管容量为 50ml，其中包括了 20ml 不含血清的 DMEM 培养基。在标本配置完毕后送入实验室进行处理，之后对滑膜细胞进行培 养。首先将滑膜组置于安全柜中，利用镊子与手术剪将样品膜组织表面的脂肪组织以及血 污组织清除，整个操作在细胞培养
3、皿环境下进行。在清理完毕后利用磷酸盐缓冲液对样本 组织进行冲洗，反复冲洗两遍，然后将样本组织移植到 DMEM 培养基中，在 DMEM 培养中加 入适量的维生素。用手术剪将样本组织剪碎，样本碎块大小约为 1mm3，再用弯镊将样本组 织进行转移，置于培养瓶内，需要注意的是在转移的过程中要保证碎块之间的间距。将培 养瓶颠倒，保证组织碎块向上，然后将培养瓶放在细胞培养箱中进行培养。在培养一段时 间后（3 小时至 4 小时）向培养瓶中添加存在青霉素抗性以及链霉素抗性的 DMEM 培养基， 添加量为 5ml，DEME 培养基中含有 20%FBS。保证培养基将样本组织碎块浸没，在培养箱中 正常培养 1 天后
4、将培养液更换，之后对培养液进行定期更换，时间间隔为 2-4 天，根据实 际情况而定。在培养的过程中可能会出现样本组织碎块浮起的现象，因此应该对培养环境 进行细致的观察，一旦出现上述情况要对漂浮组织碎块进行处理。当瓶底大部分空间（超 过 90%的瓶底面积）都被培养细胞占据时，利用胰酶进行常规消化传代，胰酶浓度为 0.3%左右，取 3 至 5 代的滑膜细胞作为检测对象。 将得到的滑膜细胞分别在正常供氧和缺氧 6 小时以及缺氧 12 小时条件下进行培养。正 常供氧环境为 21%氧气与 6%二氧化碳；缺氧环境为 2%氧气与 5%二氧化碳。 在经过上述方法培养后对所培养的 A、B、C 三组样本细胞采用蛋
5、白质印迹法进行检测。 首先对 A、B、C 三组培养细胞的总蛋白进行提取，提取量按照相关标准严格执行，然后通 过 BCA（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠）来对蛋白浓度进行测定。从提取蛋白中收集 35 微 克实验样本并与缓冲液进行混合，然后在沸水条件下进行水浴，时间为 5-10 分钟。 制备 SDS-PAGE 凝胶并对实验样本采用蛋白电泳方法进行上样，具体如下：分离胶电压控制为恒 定 80V，时间控制在 20 分钟左右；浓缩胶电压控制为恒定 100V，时间控制在 90 分钟左右。 对实验样本进行转膜，首先将滤纸放入缓冲液中进行平衡化操作，平衡时间为 25 分钟，然 后保持电流恒定，电流大小控制
6、为 41mA，在此条件下进行半干转 1 小时。利用 Tris-Hcl、 NaCl、tween20 混合液对样品膜进行冲洗，反复 2 次，冲洗时间为 10min。加入抗 HIF-1 及抗 VEGF 抗体，过夜培养，培养温度控制在 4 摄氏度，培养完成后进行洗膜。然后将相 关抗体进行二次加入，在室温条件下培育 1 小时，培养结束后洗膜。加入 ECL 发光剂进行 发光处理，并利用全自动数码凝胶成像仪进行曝光成像。通过配套工作软件对吸光度进行 扫描，并采用 -actin 作为内部参数进行修正。HIF-1 吸光度/-actin 吸光度作为 HIF-1 蛋白相对表达量；VEGF 吸光度/-actin 吸光
7、度作为 VEGF 蛋白相对表达量。对比 各组 HIF-1 及 VEGF 的表达结果。1.31.3 统计学分析统计学分析 采用 SPSS 14.5 软件系统进行分析，所有计量资料均用均数标准差表示，采用 t 检 验 P0.05 为差异有统计学意义。2.2.结果结果 表 1 A、B、C 三组 HIF-1 及 VEGF 表达结果对比组别HIF-1VEGF A 组0.16590.03410.04490.0003 B 组0.75410.00710.52290.0161 C 组1.13050.03040.62710.0081 结合上表进行分析发现，C 组的 HIF-1 以及 VEGF 表达水平最高，B 组
8、其次，A 组最 末，以上各组比较差异具有统计学意义（P0.05） 。在缺氧时间不断上升的情况下，HIF- 1 的表达水平呈递增趋势，同时 VEGF 的表达水平与 HIF-1 表达水平呈现了正相关性， 在 HIF-1 的表达水平上升的情况下，VEGF 的表达水平随之不断上升。3.3.讨论讨论 类风湿关节炎的发病群体主要为中老年人群体，近年来该病症的发病率呈上升趋势。 类风湿关节炎的具体发病机理尚不明确，但相关研究指出关节滑膜炎与类风湿关节炎的发 作有着密切的联系3。关节滑膜炎会造成患者出现关节滑膜变厚的症状，同时炎症细胞以 及炎症因子将改变正常的关节环境，造成关节缺氧，并且也会对正常的局部血液循
9、环造成 阻碍。另外随着关节滑膜炎的恶化会产生血管翳，这将给关节骨带来极大的破坏4。 在我院的研究中将 18 例类风湿关节炎患者分成了 A、B、C 三组，并以缺氧时间为变量 条件对 HIF-1 及 VEGF 在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达进行了分析。在蛋白 质印迹法检测中 A 组的 HIF-1 以及 VEGF 表达水平最低，B 组高于 A 组，而 C 组的 HIF- 1 以及 VEGF 表达水平最高(P0.05)。其中 A 组为正常供氧，B 组为缺氧 6 小时培养，C 组为缺氧 12 小时培养，可以明显看出 HIF-1 的表达水平随着缺氧时间的上升也呈现出了明显的上升趋势，而 HIF-1
10、 与 VEGF 表达也呈现了正相关性，VEGF 表达水平随着 HIF-1 表达水平的上升而上升。 HIF-1（缺氧诱导因子-1）在人体细胞内普遍存在，它在体内细胞缺氧调节方面发挥 着重要的作用。在大量的研究中发现类风湿关节炎都是在滑膜组织细胞处于缺氧状态下发 作，上述研究与该观点具有一致性。同时在缺氧环境下血清中的 VEGF 表达水平与常态相比 具有显著的上升。在缺氧情况下类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞将会以特殊的方式来进行 受体信号传导从而导致 HIF-1 被转入激活，使其表达水平提升5。 综上，HIF-1 及 VEGF 在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞中的表达呈正相关性，且 两者的表达受到了缺
11、氧条件影响，若能够对 HIF-1 的受体进行有效的阻断，这对于类风 湿性关节炎的治疗将有着十分积极的意义。 【参考文献参考文献】 1秦祖杰.类风湿关节炎的中西医诊治研究进展J.华夏医学.2011,11(02):112-113. 2黄嘉,黄慈波.类风湿关节炎的诊断治疗进展J.临床药物治疗杂志.2010,12(01):125-126. 3张风肖,孙丽君,陶杰梅.类风湿关节炎患者血清血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子 的 检测及其临床意义J.临床荟萃.2010,8(18):211-213. 4吴忠,李晶.缺氧诱导因子-1 的功能及其在类风湿关节炎滑膜炎症中的作用J.中华风 湿病学杂志.2010,7(03):312-313. 5戴辰程.缺氧诱导因子-1 与类风湿关节炎J.国外医学(免疫学分册).2010,10(05):178-179.
