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1、动脉粥样硬化遗传易感性与 DCC 基因多态性的相关性【关键词】 动脉粥样硬化关键词： 基因，DCC;串联重复序列；动脉粥样硬化；遗传易感性摘 要：目的 探讨 DCC 基因 STR 位点多态性与动脉粥样硬化遗传易感性之间的关系。 方法 利用 PCR-STR 方法对陕西正常老年人群（52 例）动脉粥样硬化（57 例）的 DCC 基因 STR 位点多态性进行群体遗传学研究，并就该位点与动脉粥样硬化关系进行关联分析。 结果 对照组陕西正常老年人群 DCC 基因 STR 位点，扩增片断基因频率分布 0.00960.3270，片断重复次数为 3792;DCC 基因 STR 位点，在正常老年人群中多态信息量
2、（PIC）为 0.754，杂合度（H）为 0.812.结果对比显示，病例组与对照组等位基因频率分布有显着差异（2 =38.792，df=13，P0.01） ，其中动脉粥样硬化组250270bp 范围内基因频率高于对照组（P0.01） ，对照组180190bp 范围内基因频率高于动脉粥样硬化组（P0.01） ；病例组与对照组杂合度与多态性分析，未见显着性差异。 结论 DCC 基因 STR 位点多态性改变可能与动脉粥样硬化遗传易感性相关联，等位基因片断长度在 250270bp 范围内的可能是动脉粥样硬化的遗传标记。Keywords:genes，DCC;tandem repeat sequences
3、;atherosclerosis;susceptibilityAbstract:AIM To study the relationship between genetic polymorphisms of DCC gene STR in Shaanxi people and its possible association with the susceptibility of atherosclerosis.METHODS Polymorphisms of DCC gene STR was studied by PCR-STR in52unrelated individuals and57at
4、heroscle-rosis samples in Shaanxi people.RESULTS The frequency of alleles which were amplified in the control group was from0.00960.3270and the number of repetition was from37to92.Polymorphism information content（PIC）of DCC gene STR was0.754and the heterozygosity（H）was0.812.The distribution of allel
5、e frequency between atherosclerosis and control group was significantly different（2 =38.792，df=13，P0.01） 。Compared to the amplified fragment of the control group，the frequency varying from250270bp in atherosclerosis group was apparently higher than that in con-trol group;however，the frequency varyin
6、g from180190bp was significantly lower than that in control one.CONCLUSION There is an association between polymorphism of DCC gene STR and atherosclerosis susceptibility.The poly-morphism of DCC gene STR may play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis.And the fragment ran-ging fro
7、m250270bp may be considered as a genetic marker of atherosclerosis.0 引言动脉粥样硬化是一种常见的心血管疾病，属多基因遗传，可能与载脂蛋白、糖尿病、吸烟等多种因素有关，而动脉内膜平滑肌细胞迁移与增殖是动脉粥样硬化形成的重要环节。DCC 基因（delected in colorectal cancer）是一种抑癌基因，位于 18q21.21 ，在细胞的增值与抑制中具有重要作用2 .现在有关动脉粥样硬化与 DCC基因 STR 位点多态性之间的研究尚无报道。我们从动脉粥样硬化人群 DCC 基因 STR 多态性研究出发，对动脉粥样硬化
8、发生发展的分子机制作了进一步研究。1 对象和方法1.1 对象 陕西地区正常老年人群 52 例（外周血） （取自唐都医院心内科并经冠状动脉造影确诊为非患病人群） ，动脉粥样硬化人群 57 例（外周血） （取自唐都医院心内科并经冠状动脉造影确诊） 。1.2 方法 常规酚/氯仿法，由外周血白细胞中提取基因组DNA，经蛋白酶 K（Sigma 公司）消化，以 PCR 法扩增，参照文献3合成引物，序列：5端和 3端引物分别为 5-GATGACATTTTCCCTCTAG-3和 5-GTGGTTATTGCCTTGAAAAG-3 （美联公司合成） 。反应体系30L，依次加入灭菌双蒸水，10Taq 聚和酶缓冲液（
9、华美公司）3L，引物各 1.5L 含基因组 DNA0.5g，dNTP2.5mmol L-1 .先预变性 9710min，然后 941min，5145s，721min，扩增 30个循环，最后 72延伸 10min（PCR 仪为 PE 公司 480 型） ，扩增产物以 PGEM-3Zf（+）DNA/HaeIII Marker 为对照产物，检测用 80g L-1 普通聚丙烯酰胺凝胶电泳（160v 电压 56h） ，EB 染色后观察，拍照，并交 BioAsia 上海博亚生物技术有限公司测序。统计学处理：计算各组等位基因频率，按 Hardy-Weinberg 平衡法，确定各样本该基因的群体代表性，用 2
10、 检验各组等位基因频率的差异，P0.05 为有显着差异，基因杂合度（H）和多态信息量（PIC）计算使用 Cooper 方法，所有统计工作均用 SSPS 软件分析完成。2 结果2.1 正常老年人群 DCC 基因多态性分布 遗传无关个体 52 例基因组 DNA 经 PCR 扩增，片断扩增范围在 150270bp，基因频率为 0.00960.3270，片断重复单位 AT（Fig1） ，重复次数为3792，以 160170bp 范围内基因频率最高（0.3270） ，其次以170180bp 和 180190bp 范围内居多，计算该位点多态信息量（PIC）为 0.754，杂合度（H）为 0.812（Tab
11、1） 。图 1 略表 1 陕西汉族老年人群 DCC 基因 STR 多态分布 略2.2 动脉粥样硬化人群 DCC 基因多态性分布 陕西地区 57 例动脉粥样硬化个体，基因组 DNA 经 PCR 扩增，片断扩增范围在145275bp，基因频率 0.00880.2800，片断重复次数为 3294，其中以 170180bp 范围基因频率最高，为 0.2800，160170bp 次之，计算该位点多态信息量（PIC）为 0.814，杂合度（H）为0.877（Tab1） 。2.3 动脉粥样硬化与对照组 DCC 基因多态性分布比较 两组等位基因频率分布存在显着差异（2 =38.972，df=13，P0.01，
12、Tab1） ，动脉粥样硬化组 250260bp 和260270bp 范围内基因频率（0.0877;0.1140）分别高于相应对照组（P0.01） ，对照组 180190bp 范围基因频率（0.1827） ，明显高于动脉粥样硬化组（0.0439） （P0.01） ，提示 DCC 基因 STR 位点多态性与动脉粥样硬化相易感性相关联，等位基因片断长度在250270bp 范围内的可能为其遗传标记（Fig2） 。3 讨论动脉粥样硬化所引发的急性心肌梗死、心绞痛、脑卒中等是严重的心脑血管疾病，已经成为严重威胁我国人民健康的主要疾病。其发病与多种因素有关，表现出明显的地域性和家族聚集现象。目前，有关动脉粥
13、样硬化的研究主要集中在载脂蛋白4 ，Rb5-7 ，p538，9 等。DCC 基因最初因为其在结肠癌中表达高频缺失而被分离鉴定，现已克隆的 cDNA 的编码序列在 4kb 以上。最近其基因组结构表明，该基因在人类基因组中跨越 1.4Mb DNA，至少由 29 个外显子构成，仅第一个内含子就有 550Kb，是迄今发现的最大的抑癌基因10，11 .通过对 DCC 基因产物氨基酸序列分析，发现其与神经细胞粘附分子以及其他相关细胞表面属于免疫球蛋白超家族的糖蛋白具有同源性12 ，这种同源性表明 DCC 基因的功能很可能在细胞间相互作用中发挥重要作用13 .而且，通过临床病理学检查，DCC 基因的等位缺失
14、仅在中度分化及低分化肿瘤中有所发现，这揭示 DCC 基因功能的丧失有可能直接参与肿瘤细胞14 的分化与扩散2 .现在对 DCC 基因的研究不仅仅局限在结肠癌15 ，其表达高频缺失在食管癌、乳腺癌、胰腺肿瘤16 、前列腺肿瘤17 和血液恶性肿瘤18，19 研究中均有报道。STR 是一种理想遗传标记，在基因连锁图谱测定，遗传性疾病相关位点的鉴别中发挥重要作用。图 2 不同组中等位基因频率分布 略通过对陕西地区正常老年人群 DCC 基因 STR 位点多态性分析显示，该位点基因分布符合 Hardy-Winberg 平衡定律，说明该基因已达遗传平衡，具有群体代表性；杂合度 0.812，PIC 为 0.7
15、54，说明该位点具有丰富的多态信息量，可作遗传标记研究基因与肿瘤关联关系。通过分析比较发现，动脉粥样硬化人群与正常老年人群，在 DCC 基因 STR 位点多态性分布中存在显着性差异（P0.01） ，其中动脉粥样硬化组，250260bp 和 260270bp 范围基因频率（0.0877;0.1140）高于对照组，而对照组 180190bp 范围基因频率（0.1827）高于动脉粥样硬化组（0.0439） 。而且，在高重复区，病例组均比对照组有明 显升高（Fig1） 。两组结果差异性，可能是在基因的复制、转录和修复过程中，由于体内外多种因素的综合影响，导致细胞周期调控基因发生功能紊乱，原癌基因被激活
16、，抑癌基因功能减弱，而使错误效应得以长期积累，表现为动脉粥样硬化组与对照组的基因频率分布存在统计学差异，显示 DCC 基因 STR 位点多态性与动脉粥样硬化遗传易感性相关联。动脉粥样硬化的发病是多基因、多阶段、多因素长期综合作用的结果。我们仅分析了 DCC 基因 STR 位点多态性改变在动脉粥样硬化行成中的作用，认为 DCC 基因可能是动脉粥样硬化的致病因素之一，其位点多态性改变与动脉粥样硬化遗传易感性相关，而对于其他调控细胞周期的基因与动脉粥样硬化关系尚未作阐述，还需进一步研究。参考文献：1Miyake S，Nagai K，Yoshino K，Oto M，Endo M，Yuaza Y.Point mutations and allelic deletion of tumor suppressor gene DCC in Human esophageal squamous cell ca
