《套式聚合酶链反应快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌》由会员分享，可在线阅读，更多相关《套式聚合酶链反应快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、套式聚合酶链反应快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌边专武汉大学口腔医学院龋病是一种细菌感染性疾病。大量研究表明，在变形链球菌组中变形链球菌和茸毛链球菌为人类的主要致病菌。长期以来，变链菌倍受关注。但近来的一些研究表明，茸毛链球菌与变链相比，可能具有更强的致龋潜力，对龋病的发生和活跃性可能更为重要。也有学者持不同意见。因此，鉴定变链菌和茸毛链球菌，研究人类口腔中这两种细菌检出率的差异，将对探索哪种细菌与龋病的发生关系更为密切，从而预测和防止龋病的发生有非常重要的意义。以往的区分和鉴定变形链球菌和茸毛链球菌的方法包括：在轻唾培养基上观察菌落形态、生化鉴定、免疫血清学鉴定、D N A 探针等方
2、法。但这些方法存在着费时、灵敏度不高等缺点。而聚合酶链反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ,简称P C R ) 在检验致病菌方面具有简便、省时、灵敏度等优点而倍受欢迎。其中，套式P C R ( n e s t e dP C R ) 对应模板的外侧及内侧分别设计内、外两对引物，经过二次P C R放大可将单拷贝的目的D N A 片段检出，明显提高P C R 检测的灵敏度和特异性。另外，近年来研究证明可通过检测唾液中致龋微生物水平，来反映口腔中致龋微生物的感染水平，并认为唾液样本适合于致龋微生物的定量检测。本项研究运用套式P C R 技术，
3、检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌，旨在探求一种适合于临床应用的、快速敏感的致龋微生物检测方法。材料与方法1 引物：分别以变形链球菌g 【f I 和茸毛链球苗群毋基因设计两组成套寡核苷酸引物。2 试剂：溶菌酶液，蛋白酶K 液，T a q 酶等3 ，细菌标准株：所使用的变链菌属( 血清型a 曲) 1 7 株，非变链菌属1 7 株4 分离、纯化、鉴定变链菌和茸毛链球菌临床菌株5 细菌染色体D N A 的提取3 m l 细菌隔夜培养物，在溶菌酶、蛋白酶K 、1 0 S D S 、等体积苯酚、氯仿抽提作用后，乙醇沉淀D N A ，离心弃上清，7 0 乙醇洗涤，溶于T E 缓冲液中。6 直接从唾液中提
4、取细菌染色体D N Al m l 唾液，4 “ C 离心，去上清，将沉淀重悬于内含2 m g 溶菌酶的2 0 0 ( I T E 液中，其它步骤同细菌染色体D N A 的提取法。7 套式P C R 扩增第一次P C R ：依次加入两对外引物t l a p 3 、t h p 4 、t h p 5 、t h p 6 及P C R 反应其它成份。反应按9 4 “ C 预变性4 r a i n ，9 4 “ 1 2 交性l m i n ，5 8 “ ( 2 退火l m i n ，7 2 延伸l m i n ，循环3 0全国涎腺疾病学术会议专题报告次，最后7 2 延伸5 m i n 。第二次P C R
5、：将第一次P C K 产物取2 0 ，稀释1 0 倍后，取2 ( 1 作模板，加入两对内引物t h p 7 、t h p S 、t h p 9 、t h p l O 各5 0 p m o l ，其它成份及步骤同第一次P C R 。7 1 O 琼脂糖( 0 5 ( g E B m 1 ) 凝胶电泳检测扩增产物结果1 P c R 反应的产物获得、特异性变链菌属中，变链菌( 血清型c , e , O 第一次P C R 扩增产物为5 1 7 b p ，第二次P C R扩增产物为4 6 8 b p ；茸毛链球菌( 血清型d ，g ) 及道勒链球菌( 血清型h ) 第一次P C R扩增产物为7 1 2 b
6、 p ，第二次P C R 扩增产物为6 6 3 b p ；而仓鼠链球菌( 血清型a ) 鼠链球菌( 血清型b ) 无扩增产物。非变链菌组的细菌没有任何扩增产物，可见该P C R 反应对变链菌和茸毛链球菌具特异性。( 图l ，2 )2 P C R 反应灵敏度分别将I m l 变形链球菌( S m u t a n s ) I n g b r i t t 株和茸毛链球菌( S s o b r i n u s ) 6 7 1 5 株隔夜培养物离心，将沉淀的菌细胞l O 倍系列稀释，提取其染色体D N A 作为模板进行P C R ，经1 琼脂糖凝胶电泳，发现以1 0 5 菌落形成单位( c o l o
7、n y - f o r m i n gu n i t s ，C F t O的D N A 作模板进行P C R ，仍可见特异性扩增带。而第二次P C R 反应后，发现仅1 0 3 C F U的D N A 作模板都有特异性扩增带。( 图3 ，4 )3 P C R 检测临床菌株临床菌株经提取D N A ，进行P C R 反应后，均有其特异性产物。( 图5 )4 P C R 检测唾液样本P C R 检测唾液样本的典型结果为：A 研究对象在第一次P C R 反应中扩增出变链菌的特异性产物，第二次P C R 反应中扩增出茸毛链球菌的特异性产物，说明A 唾液中拥有茸毛链球菌1 0 3 - - ( 1 0 5
8、 C F U m l 唾液，变链菌( 1 0 5 C F U m l 唾液。B 研究对象仅扩增茸毛链球菌的特异性产物，证明B 唾液中拥有茸毛链球菌( 1 0 5 C F U m l 唾液，变链菌1 0 3 C F U m l 唾液。c 对象可扩增出变链菌和茸毛链球菌的特异性产物，说明C唾液中拥有变链菌，茸毛链球菌( 1 0 5 C F U m l 唾液。( 图6 ，7 )讨论已有研究表明，唾液，由于容易获得、易于定量、拥有口腔中所有部位的细菌等原因，是评价龋病易感性和活跃性的良好样本之一。但唾液除含有口腔细菌外，还含有白细胞，脱落的上皮细胞、食物残渣等，有些成分可能会抑制P C R 反应，导致
9、假阴性结果。本实验采用细胞裂解法及苯酚、氯仿提取D N A 法，使P C R 模板D N A 中不含有抑制P C R 的成分。由于P C R 比经典的细菌培养法简便、高效、快速( 仅需6 小时) ，更加适合于临全国涎腺疾病学术会议专题报告床样本中致龋菌的检测。本实验采用套式P C R ，第一次P C R 能检测( I O S C F U 细菌，第二次P C R 能检测( i 0 3 c F U 细菌。两次连续放大可以提高P C R 检测的灵敏度和特异性。同时；针对个体研究对象l m l 唾液样本进行P C R 的结果可将细菌感染水平分为三个水平：( 1 0 5 C F U ，为高度感染对象；1
10、 0 3 ( 1 0 5 C F U ，为中度感染对象；( 1 0 3 C F U ，为低度感染对象。因此，套式P C R 法可分辨变链菌与茸毛链球菌，并可以通过比较两种细菌数量上的差异，结合龋患状况( 如以龋失补D M F 为指标) ，迸一步探索哪种细菌与龋病易感性关系更加密切，为预防龋病的发生奠定基础。R a p i dd e t e c t i o no fS t r e p t o c o c c u sm u t a n sa n dS t r e p t o c o c c u ss o b r i n u si nh u m a ns a l i v ab yN e s t e
11、d - P o l y m e r a s eC h a i nR e a c t i o nB i a nZ h u a nS c h o o lo fS t o m a t o i o g y , W u h a nU n i v e r s i t yA b s t r a c tO b j e c t i v e ：T h ea i mo ft h i ss t u d yw a sd i r e c td e t e c t i o no fs t r e p t o c o c c u sm u t a n sa n dS t r e p t o c o c c u ss o b
12、f m u si nh u m a ns a l i v aa n dt oe s t a b l i s has i m p l em e t h o dt oe x p l o r et h er e l a t i o nb e t w e e nb a c t e r i aa n dc a r i e s M e t h o d ：T h em e t h o dw a sd k e ad e t e c t i o no fS m u t a n 8a n dS s o b r i n u si nh u m a ns a l i v ab yn e s t e dP C R T
13、w oS e t so fo l i g o n u c l e o f i d ep r i m e r ss p e c i f i cf o rp o r t i o n so ft h eg l u c o s y l t r a n s f e r a s eg e n e s t 3o f S m u t a a sa n d 鲜nS s o b r i n u s ) w e r ed e s i g n e dN e s t e dP C Rw a sf i r s t l yu s e dt od e t e c ts t a n d a r da n dc l i n i
14、c a ls t r a i n so fS m u t a n sa n dS s o b r i n u s t h e nu s e dt od i r e c td e t e c t i o no fSm u t a n sa n dS s o b r i n u si nh u m a ns a l i v a +R e s u l t s ：N e s t e dP C Rw a sc a p a b l eo f d e t e c t i n gS m u t a n sa n dS s o b r i n u ss p e c i f i c a l l ya n dd i
15、 r e c t l yi nh u m a ns a l i v aa n da sf e wa s1 0 3c o I o n v f o 衄i n gu n i t so f c e l l s C o n c l u s i o n ：N e s t e dP C Rc o u l dd e t e c tS m u t a n sa n dS s o b r i n u ss p e c i f i c a l l ya n ds e n s i t i v e l yw h i c hw e r ep r e f e r a b l et oo r d i n a r yP C R
16、 F u r t h e r m o r e ，n e s t e dP C RW a Sc a p a b l eo fs p e c i f i c a l l ya n ds e n s i t i v e l yd e t e c t i n gS m u t a n sa n dS s o b r i n u si nh u m a ns a l i v am o r es i m p l ya n dr a p i d l yt h a nb a c t e r i ac u l t u r e ，w h i c hm i g h ta p p l yt os t u d i e so ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nc a r i o g e n i cb a c t e r i aa n dc a r i e sK e yw o r d s ：S t r e p t o c o c c u sm u t a n
