《原发性肝癌中肝细胞生长因子mRNA的定量表达及其临床意义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《原发性肝癌中肝细胞生长因子mRNA的定量表达及其临床意义（10页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ mRNA 的定量表达及的定量表达及其临床意义其临床意义作者：浦涧，汪建初，韦忠恒，李良波，韦建宝，严浩然，覃志坚 作者单位：右江民族医学院附属医院，广西百色 533000【摘要】目的 对原发性肝癌组织、癌旁组织以及正常肝脏组织肝细胞生长因子(HGF) mRNA 进行定量测定，分析其表达与临床特征的关系，探讨其临床意义。方法 采用实时荧光定量 PCR 检测 59 例原发性肝癌组织、相对应癌旁组织以及 17 例正常肝脏组织HGF mRNA 的表达量，分析其表达量与性别、年龄、血清HBsAg、AFP、分化程度、肿瘤大小、临床分期、转移状态以及是否合并肝硬化等
2、临床特征的关系。结果 HGF mRNA 在原发性肝癌组织、癌旁组织中的表达与正常肝脏组织差异无显著性(P0.05)。HGF mRNA 在肝癌合并肝硬化组中的表达明显高于未合并肝硬化组(P0.05). There were no significant correlations between HGF mRNA and other clinicopathologic characters as well. Conclusions The HGF mRNA expression increased significantly in HCC patients complicated with liv
3、er cirrhosis, suggesting that it may be correlated with the development of HCC.KKME-专业医学搜索引擎 http:/ words: liver neoplasms; polymerase chain reaction; hepatocyte growth factors; proto-oncogene protein c-met肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)又称肝细胞扩散因子( hepatocyte scatter factor, HSF)，是目前研究促进肝细胞增殖最
4、强的细胞因子，其受体 c-Met (原癌基因的表达产物)过表达于多种肿瘤细胞，HGF 作用于受体 c-Met，形成了 HGF/c-Met 信号转导系统，体外实验表明 HGF 能刺激多种肿瘤细胞的分裂、增殖、运动、离散，与肿瘤的发生、发展关系密切1,2。有研究显示血清 HGF 水平在多种肿瘤包括肝癌中显著增高35，且 HGF mRNA 在肝癌诱变不同时期表达存在差异6。然而，HGF mRNA 在原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的表达以及与其临床特征的关系未见文献报道，本研究采用实时荧光定量 PCR 检测 HGF mRNA 在原发性肝癌中的表达，初步探讨其与
5、原发性肝癌的发生、发展、浸润转移的关系以及临床应用的意义。1 材料与方法1.1 标本来源所有 59 例标本均来自 20022006 年右江民族医学院附属医院手术切除标本，手术切除组织立即液氮冻存，肿瘤组织均经病理检查证实，为原发性肝细胞癌。其中男 43 例，女 16 例，年龄(48.612.4)岁。癌旁组织取自距上述肝癌病变边缘 2.0cm 的肝组织共 59 份。另取肝外伤病人的正常肝脏 17 份作为正常对照，其中男10 例，女 7 例，年龄(46.911.2)岁。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 仪器与试剂Trizol Reagent、SuperScript 逆转录试剂盒、DNase
6、购自美国 Invitrogen 公司，PCR 试剂购自上海申能博彩生物公司。SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 扩增采用 TaKaRa(宝生物工程大连有限公司)试剂盒。HGF 引物：上游：5-TGCTCCCCATCGCCATCCCCTATG-3;下游：5-TATAGCACCATGGCCTCGGCTGG-3，产物长度为：756bp。GAPDH：上游引物：5-CCAATATGATTCCACCCATG-3;下游引物：5-GAGAAGGCTGGGGCTCATTT-3，产物长度为:195 bp，引物由上海英俊生物有限公司合成。ABI7500 荧光定量 PCR 仪为美国 ABI 公司产品。1.
7、3 总 RNA 抽提及反转录取冻存组织 100mg，加入 Trizol Reagent 1ml，匀浆后加入0.2ml 氯仿，离心后吸取上清，加入 0.5 ml 异丙醇，离心沉淀后弃上清，70%乙醇洗沉淀，DNase I 酶解可能残余的基因组 DNA，RNA溶于 DEPC 水，甲醛变性凝胶电泳和以 260nm 及 280nm 吸光度值计算所获 RNA 含量及纯度，分装后-80保存待用。反转录操作按Superscript (Invitrogen 公司)提供操作说明书进行，所得 cDNA -20保存。1.4 实时荧光定量 RT-PCR 扩增效率检测用 EASY Dilution 将 cDNA 液按
8、100、101、102、103 和104 梯度稀释后，各取 2l 进行荧光定量 PCR 反应，检测目的基因KKME-专业医学搜索引擎 http:/ GAPDH(管家基因) 的扩增效率的一致性，Ct 值为荧光信号强度超过设置的阈值强度时所经历的循环数。Ct=Ct(HGF)-Ct(GAPDH)。1.5 实时荧光定量 PCR25l 反应体系中含 cDNA 样品 2.0l，SYBR Premix Ex TaqTM(2)12.5l，上、下游引物(20pmol/l)各 0.5l，Rox Reference Dye 0.5l，去离子水补足 25l。设置 95预变性10s，95变性 5s，61延伸 31s，共
9、 40 个循环。以 GAPDH 为内对照。采用比较循环阈值法(2-Ct)分析样本中 HGF 的相对含量7。具体计算方法如下：以正常肝组织作为对照因子，设为 1，分别将肝癌组织、癌旁组织与正常肝组织做比较，得倍数为 N(N=2-Ct)，其中 Ct=Ct(癌或癌旁组织)-Ct (正常肝组织)。1.6 统计学分析采用 SPSS 11.5 统计软件包进行统计学处理，各组之间的差异采用完全随机设计资料方差分析，数据之间的两两比较采用SNK 法，肿瘤的临床资料参数间的比较采用两组独立样本 t 检验。2 结果2.1 总 RNA 完整性检测琼脂糖凝胶电泳检测提取的 RNA 的完整性，紫外下观察电泳结果，可见
10、28S、18S、5S 三条清晰的条带，其中 28S 和 18S 条带明亮，表明提取的 RNA 完整(见图 1)。且熔解曲线显示特异性较好(见图 2)，可用于实时荧光定量 PCR。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 实时荧光定量 RT-PCR 扩增效率检测结果原发性肝癌组织中 HGF 和 GAPDH 的 cDNA 经梯度稀释后，其相对关系数分别为 0.9995 和 0.9994，斜率分别为-3.444 和-3.487，扩增效率分别为 1.94 和 1.95。可以认为目的基因的扩增效率与管家基因的扩增效率相同，浓度改变时样本的扩增效率可保持稳定，误差在可容许的范围内，故可用 Ct 方法进行相
11、对定量。2.3 实时荧光定量 PCR 对 HGF mRNA 表达的检测HGF mRNA 在原发性肝癌组织和癌旁组织中的表达稍高于正常肝脏组织，但差异无显著性(P0.05)，见表 1。原发性肝癌组织HGF mRNA 的表达与临床特征的关系，见表 2。HGF mRNA 在肝癌合并肝硬化组中的表达明显高于未合并肝硬化组(P0.05)。表 1 正常肝组织、肝癌组织及癌旁组织 HGF mRNA 的表达情况(略)表 2 原发性肝癌组织 HGF mRNA 的表达与临床特征的关系(略)3 讨论肝细胞生长因子(HGF)最初是从大鼠血浆和血小板中分离得到的一种分泌型肝素亲和糖蛋白，是目前研究的生物学活性最广泛的生
12、长因子。现已知，由间质细胞产生，通过旁分泌方式作用于邻近细胞，与细胞表面的受体 c-Met 结合并激活该受体的酪氨酸激酶活性从而促进包括肝细胞、上皮细胞、内皮细胞、黑色素细胞、造血细胞等多种类型细胞的生长、迁移和形态发生。在胚肝和胎盘KKME-专业医学搜索引擎 http:/ HGF 水平明显升高，且可作为预后指标4，5，此外，HGF mRNA 在大鼠肝癌诱变过程中不同时期表达存在明显差异6。本研究采用实时荧光定量 PCR 定量检测 HGF mRNA 在原发性肝癌中的表达，结果显示 HGF mRNA 在原发性肝癌中的表达与其在正常肝脏中的表达无明显差异，且与性别、年龄、血清HbsAg、血清 AF
13、P 水平、肿瘤大小、肿瘤分化程度、临床分期以及转移状态等临床特征无关，但合并肝硬化的肝癌 HGF mRNA 的表达明显高于未合并肝硬化组，提示肝癌组织中 HGF mRNA 升高可能是由于肝硬化引起的。肝硬变早期肝细胞变性、坏死，肝细胞损伤严重，产生大量 HGF，促进了肝脏再生与修复，肝硬变期肝细胞损伤趋于稳定，肝组织大量纤维化，HGH mRNA 表达下降，说明HGF 产生也将减少;在肝细胞癌变后，HGF mRNA 表达下降至正常。大量 HGF 对肝细胞分化增殖产生过度刺激的作用，有利于肝细胞的恶性转化及肝癌发生。由此推测，HGF mRNA 可能与肝癌的发生发展有关。HGF 对肝细胞癌的作用尚无
14、定论，Tajima 等8于 1991 年首次报道 HGF 能够抑制某些肝癌细胞株的增殖活性，HGF 浓度达到 110ng/ml 时，肝癌细胞株 HepG2 的细胞增殖明显受到抑制。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Von 等9观察到未被完全切除的肝母细胞瘤患儿术后 4 周内残余肿瘤生长迅速，与肝细胞最强的增生期相一致，同时伴有血清 HGF的升高，这一现象提示残余肿瘤生长的加速可能与 HGF 分泌的增加有关。Miyazaki 等10也观察到 HGF 对 HUH-6 细胞株有刺激生长的作用。到目前为止，体外实验研究表明外源性 HGF 既能抑制某些肝癌细胞株的增生(HepG2，Fao，HuH
15、7)，又能促进另一些肝癌细胞株的增生(HuH6，Clone5)或对某些细胞株(HLE，HuH7，PLC5)无影响。有研究提示 HGF 对 HCC 细胞的作用与 HCC 细胞内 HGF/c-Met依赖性信号传导通路的改变有关2，HGF 对不同来源的人 HCC 细胞有不同的生长效应，也可能是因为不同细胞株中这一机制的改变存在差异所致，具体机制如何有待深入研究。综上所述，本研究通过实时荧光定量 PCR 定量检测原发性肝癌、癌旁组织及正常肝脏组织中 HGF mRNA 的表达，并分析其与临床特征的关系，发现肝癌合并肝硬化患者 HGF mRNA 水平明显增高，虽然目前尚不清楚其准确分子机制，但本研究结果为今后进一步深入研究 HGF 基因表达与原发性肝癌发生发展之间的机制奠定了有利的基础。【参考文献】1Tamatani T, Hattori Kiyer A. Hepatocyte growth factor is an invasion/migration factor of rat urothelial carcinoma cells in vitro
